ELISA方法在實際操作中遇到的常見問題

a．樣品稀釋 酶聯免疫反應是一種敏感性很高的反應，如果血清不稀釋，不可避免會(hui) 產(chan) 生很強的非特異性反應，出現假陽性。因此，國外檢測血清抗體(ti) 的試劑盒，均規定將血清稀釋至適當的倍數，以降低非特異性反應，使特異性的抗原抗體(ti) 反應充分體(ti) 現出來。一般產(chan) 品的樣品稀釋倍數均通過大量試驗確定，以保證試驗的靈敏度和特異性。但是，有些用戶未能嚴(yan) 格按使用說明書(shu) 操作，如某些產(chan) 品應取10μl樣品進行稀釋，個(ge) 別用戶取5μl甚至1μl樣品進行稀釋，由於(yu) 吸嘴上不可避免地沾有樣品以及微量移液器的精度不夠，因此造成樣品稀釋倍數不準確，檢測結果出現問題。 b．加樣 在現在的ELISA商品試劑盒中，必然有使用微量加樣器加入樣本的步驟。注意的關(guan) 鍵點是：加樣不可太快，要避免加在孔壁上部，不可濺出和產(chan) 生氣泡。加樣太快，無法保證微量加樣的準確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區，易導致非特異吸附。濺出會(hui) 對鄰近孔產(chan) 生汙染。出現氣泡則反應液界麵有差異。所以，有時候一份標本用相同的試劑盒這次測定為(wei) 陽性，下次測定為(wei) 陰性，往往就是上述加樣及試劑的錯誤所致。   c．試劑盒平衡 試劑盒中所有試劑和板條均應在試驗前平衡至室溫（約25℃），一般需在室溫放置20～30分鍾以上。平衡時間太短會(hui) 造成試劑混勻不夠，樣品孵育時間相對縮短，ELISA反應不夠充分。冬季室溫低，可將試劑盒置37℃溫箱20分鍾。 d．樣品和試劑的混勻 稀釋前、後的樣品必須充分混勻，所有試劑在加樣前也須搖勻，以保證試驗的均一性。 e．溫育 溫育是ELISA測定中影響測定成敗zui為(wei) 關(guan) 鍵的一個(ge) 因素。ELISA作為(wei) 一種固相免疫測定，抗原抗體(ti) 的結合反應在固相上進行，要使液相中的抗原或抗體(ti) 與(yu) 固相上的特異抗體(ti) 或抗原*結合，必須在一定的溫度條件下反應一定的時間。溫育所需時間與(yu) 溫度成反比，即溫度越高，則所需時間相對較短。zui為(wei) 常用的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2～8℃。一些操作者，擅自改變說明書(shu) 操作，使用自己喜歡的溫育時間和溫育溫度，這樣造成一些不必要的麻煩。因為(wei) ，不同試劑盒有不同的溫育時間和溫育溫度的選擇，隨意更改溫育時間或者溫育溫度將導致試驗結果出現偏差。 6．洗板 固相免疫測定技術是一種非均相免疫測定技術，需以洗滌操作將特異結合於(yu) 固相的抗原或抗體(ti) 與(yu) 反應溫育過程中吸附的非特異成份分離開來，以保證ELISA測定的特異性。洗板對於(yu) ELISA測定來說，也是極其關(guan) 鍵的一步。洗液盡量不要溢出孔外；加洗液後要靜置1分鍾，甩去板孔中洗液後，一定要大力拍幹；及時更換吸水紙，尤其是拍過酶標記物的吸水紙一定要棄去，否則可能影響試驗結果。 7．邊緣效應 使用96孔板的ELISA測定中，常發現有“邊緣效應”，即外周孔顯色較中心孔深。經研究證實在溫育中的熱力學梯度可能是根本原因之所。聚苯乙烯本身為(wei) 不良熱導體(ti) ，在實驗室的常規ELISA測定中，將板從(cong) 室溫（通常在25℃左右）置於(yu) 37℃溫箱，板也升溫時，在外周孔與(yu) 中心孔之間可能存在一熱力學梯度。因此使用水浴或在將反應溶液加入至板孔中時，將板和溶液均加熱至溫育溫度（如37℃），就可以很容易地排除“邊緣效應”，並且可提高測定的重複性。 8．顯色 顯色一定要控製時間,根據試劑盒說明操作即可。一般來說，顯色時間過短，結果偏低；顯色時間過長，空白增高或者非特異性顯色增加。 9．比色 比色要注意波長的選擇。以TMB為(wei) 底物和以OPD為(wei) 底物的試劑盒均有使用，而前者比色波長為(wei) 450nm，後者為(wei) 492nm，濾光片需根據要求隨時更換。因此，容易出現濾光片錯用的問題。 其次，單波長或雙波長比色選擇的問題。所謂的單波長比色即是通常的以對顯色具有zui大吸收的波長如450nm或492nm進行比色測定；而雙波長雙色則酶標儀(yi) 在敏感波長如450nm和非敏感波長如630nm下各測定一次，敏感波上下的吸光度測定值為(wei) 樣本測定酶反應特異顯色的吸光度與(yu) 板孔上指紋、刮痕、灰塵等髒物所致的吸光度之和；非敏感波長下測定即改變波長至一定值，使得樣本測定酶反應特異顯色的吸光度值為(wei) 零，此時測得的吸光度即為(wei) 髒物的吸光度值。zui後酶標儀(yi) 給出的數值為(wei) 敏感波長下的吸光度值與(yu) 非常感波長下的吸光度值的差。因此，雙波長比色測定具有能排除由微滴板本身、板孔內(nei) 標本的非特異吸收、指紋、刮痕、灰塵等對特異顯色測定吸光度的影響的優(you) 點。由於(yu) ELISA測定中單個(ge) 空白孔的非特異吸收上有一定程度的不確定性，也就是說每次測定或同次測定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度測定值，故而在ELISA測定比色時，是使用雙波長比色。 綜上所述，盡管ELISA測定的操作步驟非常簡單，但有可能會(hui) 影響測定結果的因素卻較多，分布在測定操作的各步之中，尤以加樣、溫育和洗板為(wei) 甚。為(wei) 幫助大家分析查找測定中出現問題的可能原因，特對常見問題及原因歸納總結於(yu) 下表。 操作過程中可能出現的問題和解決(jue) 方法 問題 可能原因 解決(jue) 方法 顯色淡，靈敏度偏低 1、試劑盒在運輸途中時間太長，溫度太高 盡量縮短運輸時間，夏季應放冰塊降溫 2、試劑盒未充分平衡 試劑盒從(cong) 2～8℃冰箱取出後打開盒蓋，於(yu) 室溫平衡至少20分鍾，確保所有試劑已平衡至室溫（約25℃）。 3、培養(yang) 箱溫度不足37℃ 注意培養(yang) 箱溫度，放入反應板後盡量減少開啟次數以免影響溫度恒定，非隔水式培養(yang) 箱尤其應注意 4、保溫時間不足 校正定時鍾準確定時 5、洗滌時衝(chong) 擊力太大、浸泡時間過長、洗滌次數增加 按說明書(shu) 要求保留洗滌時間，準確記住洗滌次數 6、移液器吸液量不足，吸嘴內(nei) 壁掛水太多或內(nei) 壁不清潔 校正移液器，吸嘴要配套，裝吸嘴時要緊密，吸嘴內(nei) 壁要清潔，一次性使用 7、蒸餾水水質有問題 使用新鮮合格的蒸餾水 8、底物作用時間不足 準確定時 背景深，全部呈有色, 1、洗滌不充分，洗後未拍幹，樣品中其它成分殘留或酶標記物殘留 濃縮洗液準確配製；10倍濃縮洗滌液如有結晶則應讓結晶於(yu) 室溫全部溶解後再量取稀釋；充分洗滌，*拍幹。加樣或加酶拍板的濾紙應棄去不用，不要反複使用，否則易造成汙染 2、樣品汙染 樣品應新鮮采集，或低溫保存，防止汙染 3、培養(yang) 箱溫度超過37℃或反應時間過長 調整培養(yang) 箱溫度，準確定時 4、吸嘴重複使用，未洗淨或消毒不* 吸嘴盡可能一次性使用 5、蒸餾水被汙染 使用新鮮蒸餾水 6、酶等試劑混用 不同批號試劑勿混用 7、一次實驗的標本量過多，加樣時間太長，導致實際反應時間延長 合理安排實驗，避免幾塊酶標板同時加樣 重複性不佳 1、樣品數量多少不一，加樣時間有長有短 重複某一樣品時，加樣時間盡可能與(yu) *次接近 2、保溫時間不一致，洗滌條件不一致，操作人員不一致 重複測定標本，操作條件、人員等應盡可能與(yu) 上次保持一致，以排除這些因素造成的不一致的可能性 3、加樣量不一致 樣品稀釋前應充分混勻，盡可能使用同一移液器並裝緊吸嘴 出現白板，陽性對照不顯色 顯色液變質 更換新的顯色液 洗滌液配製有誤 請按說明書(shu) 所示稀釋倍數配製 未加酶結合物而認為(wei) 已加入 注意不要漏加 終止液誤作洗滌液稀釋或當底物液使用 每次加液前均應看清標簽

ELISA方法被廣泛應用於(yu) 各種抗原和抗體(ti) 測定。但ELISA測定中影響因素較多，而且其操作中有一定的技術要求，在檢測過程中除正常反應外，有時常見到一些錯誤的結果。引起ELISA測定錯誤結果的原因主要有：①標本因素；②試劑因素；③操作因素。下麵就一些常見ELISA操作過程中的問題一一分析。

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