石蠟包埋組織切片免疫染色

實驗步驟（建議方案）：

石蠟包埋組織切片3~4μm 厚度

1.烤片： 將待做切片置於(yu) 切片架上，於(yu) 60℃恒溫烤箱中至少烤1 hr；

2.脫蠟： 切片放入盛有二甲本苯的容器中脫蠟3次（即二甲本苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），每次10 min；

3.水化： 切片經下行酒精水化，無水乙醇5min，95%乙醇2次（每次2min），85%乙醇2 min；75%乙醇2min，自來水衝(chong) 洗，ddH2O洗2×2min；

4.抗原修複： 根據抗體(ti) 說明書(shu) 推薦方法進行抗原修複，常采用高壓、微波（溫度達到98~100℃）或酶消化修複法，室溫自然冷卻，自來水衝(chong) 洗，ddH2O洗2×2min，TBS洗滌（2×2min）（具體(ti) 修複方法見附1）* 注：有些抗原勿需修複，直接進入第5步封閉。

5.封閉： 滴加試劑B，37℃濕盒孵育30 min；

6.加一抗：滴加用試劑C（即用型一抗），37℃濕盒孵育2 hr 或4℃過夜；

7.洗滌： TBS-T洗滌（3×5 min）；

8.封閉： 滴加試劑B，37℃濕盒孵育10 min；

9.加二抗： 滴加用抗體(ti) 稀釋液稀釋的生物素化二抗（試劑D），37℃濕盒中孵育30 min；

10.洗滌： TBS-T洗滌（3×5 min）；

11.封閉： 滴加試劑Tween 20，37℃濕盒孵育封閉20 min；

12.加HRP-SA： 滴加用抗體(ti) 稀釋液稀釋的試劑E（1：50~200，終濃度5~20 nM），37℃濕盒中孵育30 min；

13.洗滌： TBS-T洗滌（3×5 min），TBS洗滌（2×5 min）；

14.顯色：應用DAB溶液（試劑F）顯色；

15.複染：自來水充分衝(chong) 洗，複染，脫水，透明；

16.封片： 待組織標本幹後，用試劑緩衝(chong) 甘油封固劑封片；

17.觀察成像： 顯微鏡下觀察成像。

注意事項：

1. 修複後緩衝(chong) 液須自然冷卻，自來水衝(chong) 洗後方能把切片取出，驟冷有可能導致結晶或抗原封閉。

2. 緩衝(chong) 液的量必須保證所有切片都能浸泡到，用過的檸檬酸緩衝(chong) 液不能反複使用。

3. 若試劑為(wei) 微量濃縮液，用前應低速離心，將內(nei) 蓋和管壁附著的溶液離到底部。

4. 封片前一定要換用TBS充分洗滌，以便洗去組織上殘留的Tween 20，否則會(hui) 影響結果觀察。

5. 如須複染細胞核，則在封片前複染或直接采用含有染核試劑的封片劑進行封片。