大鼠神經絲(si) 蛋白（NF）免疫組化試劑盒
該試劑盒以HRP標記的鏈黴親(qin) 和素複合物（HRP Streptavidin Conjugate，HRP-SA）為(wei) 基礎，可用於(yu) 檢測細胞、組織內(nei) 的特異性神經絲(si) 蛋白（NF）抗原。該試劑盒具有靈敏度高、特異性強、定性定位準確、背景清晰。在所用的神經絲(si) 蛋白（NF）一抗與(yu) 相應靶抗原結合後，用生物化二抗與(yu) 一抗特異性結合，後加入HRP-SA，形成抗原—特異一抗—生物素化二抗—HRP-SA複合物，顯微鏡下觀察成像。
試劑盒所含試劑：
試劑A 通透液：0.1% Triton-X 100 10 mL（選用）
試劑B 封閉緩衝(chong) 液（封閉用） 20 mL
試劑C （*分裝）已稀釋的即用型神經絲(si) 蛋白（NF）一抗（2.5ml）
試劑D （*分裝）生物素化羊抗兔IgG 1支
（濃度1.5 mg/mL，稀釋比為(wei) 1:300~1:500）50 μL+抗體(ti) 稀釋液20ml
試劑E HRP-SA複合物1支（濃度1 μM，稀釋比1:50~1:200）100 μL
試劑F DAB顯色液 5ml
用戶自備試劑：
1． 10mM TBS（pH7.2~7.4）
三羥基氨基甲完烷1.21g
氯化鈉7.6g
加蒸餾水800mL，濃鹽酸調pH值至7.2~7.4，後定容至1000mL
TBS-T：TBS+Tween 20（0.05%體(ti) 積比）
2．抗原修複液（依檢測抗原不同而選擇不同的修複液）
10mM pH6.0 檸檬酸緩衝(chong) 液
檸檬酸0.38g
檸檬酸三鈉2.45g
加蒸餾水900mL，濃鹽酸調pH值至6.0，後定容至1000mL
或：0.5M EDTA修複液（pH8.0）
EDTA·2H2O 186.1g
檸檬酸三鈉2.45g
加蒸餾水700mL，用10mM NaOH調pH值至8.0，後定容至1000Ml
3. 緩衝(chong) 甘油封固劑10 mL
4. Tween 20 5 mL
石蠟包埋組織切片免疫染色
實驗步驟（建議方案）：
石蠟包埋組織切片3~4μm 厚度
1.烤片： 將待做切片置於(yu) 切片架上，於(yu) 60℃恒溫烤箱中至少烤1 hr；
2.脫蠟： 切片放入盛有二甲本苯的容器中脫蠟3次（即二甲本苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），每次10 min；
3.水化： 切片經下行酒精水化，無水乙醇5min，95%乙醇2次（每次2min），85%乙醇2 min；75%乙醇2min，自來水衝(chong) 洗，ddH2O洗2×2min；
4.抗原修複： 根據抗體(ti) 說明書(shu) 推薦方法進行抗原修複，常采用高壓、微波（溫度達到98~100℃）或酶消化修複法，室溫自然冷卻，自來水衝(chong) 洗，ddH2O洗2×2min，TBS洗滌（2×2min）（具體(ti) 修複方法見附1）* 注：有些抗原勿需修複，直接進入第5步封閉。
5.封閉： 滴加試劑B，37℃濕盒孵育30 min；
6.加一抗：滴加用試劑C（即用型一抗），37℃濕盒孵育2 hr 或4℃過夜；
7.洗滌： TBS-T洗滌（3×5 min）；
8.封閉： 滴加試劑B，37℃濕盒孵育10 min；
9.加二抗： 滴加用抗體(ti) 稀釋液稀釋的生物素化二抗（試劑D），37℃濕盒中孵育30 min；
10.洗滌： TBS-T洗滌（3×5 min）；
11.封閉： 滴加試劑Tween 20，37℃濕盒孵育封閉20 min；
12.加HRP-SA： 滴加用抗體(ti) 稀釋液稀釋的試劑E（1：50~200，終濃度5~20 nM），37℃濕盒中孵育30 min；
13.洗滌： TBS-T洗滌（3×5 min），TBS洗滌（2×5 min）；
14.顯色：應用DAB溶液（試劑F）顯色；
15.複染：自來水充分衝(chong) 洗，複染，脫水，透明；
16.封片： 待組織標本幹後，用試劑緩衝(chong) 甘油封固劑封片；
17.觀察成像： 顯微鏡下觀察成像。
注意事項：
1. 修複後緩衝(chong) 液須自然冷卻，自來水衝(chong) 洗後方能把切片取出，驟冷有可能導致結晶或抗原封閉。
2. 緩衝(chong) 液的量必須保證所有切片都能浸泡到，用過的檸檬酸緩衝(chong) 液不能反複使用。
3. 若試劑為(wei) 微量濃縮液，用前應低速離心，將內(nei) 蓋和管壁附著的溶液離到底部。
4. 封片前一定要換用TBS充分洗滌，以便洗去組織上殘留的Tween 20，否則會(hui) 影響結果觀察。
5. 如須複染細胞核，則在封片前複染或直接采用含有染核試劑的封片劑進行封片。
附1：
抗原修複方法
常用抗原修複液：檸檬酸緩衝(chong) 液（0.01M pH6.0）、EDTA抗原修複液（pH8.0或9.0）等等。
一、酶消化修複法
切片脫蠟水化處理，TBS衝(chong) 洗，在組織上滴加胃蛋白酶或胰蛋白酶，37℃孵育20~30min後TBS衝(chong) 洗即可。
二、微波抗原修複法
微波盒中加入抗原修複液微波加熱至沸騰，將脫蠟水化後的切片置於(yu) 耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩衝(chong) 液中，中檔或繼續微波10~15min，取出微波盒冷卻至室溫後，自來水衝(chong) 洗，取出切片。因不同微波爐微波處理時間存在差異，須自行調整。
三、直接高壓抗原修複法
取修複液於(yu) 不鏽鋼高壓鍋中加熱至沸騰，將組織切片置於(yu) 耐高溫切片架上，修複液沸騰後放入切片架，蓋上鍋蓋，待噴氣後計時1.5~2.5min即可脫離熱源，自然冷卻至室溫後自來水衝(chong) 洗，取出切片。此方法適用於(yu) 較難檢測或核抗原的修複。
四、隔水式高壓抗原修複法
不鏽鋼高壓鍋中加自來水加熱至沸騰，微波盒中加入修複液於(yu) 微波爐中加熱至沸騰，將切片放入微波盒中，再將微波盒放入高壓鍋中蓋上鍋蓋，待噴氣後計時4~8 min即可關(guan) 閉熱源，自然冷卻至室溫後自來水衝(chong) 洗，取出切片。此方法適用於(yu) 較難檢測或核抗原的修複。
