聚合酶鏈式反應ELISA法

聚合酶鏈式反應（PCR)是分子生物學技術中檢測DNA靈敏的方法之一，而酶聯免疫吸附測定法（ELISA）是免疫學中敏感和特異的檢測方法的代表。聚合酶鏈式反應ELISA法（PCR-ELISA）集上述兩(liang) 方法之精髓，成為(wei) 繼PCR之後又一個(ge) 靈敏性更高、特異性更強、省時易行的新方法[7]。根據生物素和地穀新標記底物的不同，PCR-ELISA主要分為(wei) 兩(liang) 大類：類為(wei) 用生物素和地穀新同時對PCR產(chan) 物進行標記；第二類則是分別對PCR擴增產(chan) 物和核酸雜交探針進行標記。

生物素和地穀新同時標記PCR產(chan) 物主要有三種途徑：①在PCR反應混合物中同時加入生物素和地穀新標記的脫氧核苷酸類似物（DIG-Bio-dUTP);②加入生物素化的引物和DIG-dUTP;③加入生物素化引物1和地穀新標記的引物2。實驗方法如下：將標記的PCR產(chan) 物用乙醇沉澱，或用純化柱除去未結合的標記物，加至親(qin) 合素包被的酶標板孔中孵育1~2h，*洗滌，加抗地穀新抗體(ti) ，然後加入堿性磷酸酶結合物底物孵育，終止反應後，根據吸光度（A）值判斷結果。這類親(qin) 合素介導的固相捕獲生物素標記的靶分子檢測係統，靈敏度高於(yu) PCR檢測，且操作簡便、快速，重複應用性好，可以在短時間內(nei) （<4h）準確檢測大量的臨(lin) 床標本（血清、分泌液或甲醛固定標本）；通過適當調整PCR循環次數及相關(guan) 參數並對多時間點上產(chan) 量進行線性分析，可對PCR產(chan) 物進行定量分析。由於(yu) 檢測係統是建立在雙標記核酸片段上的，有時會(hui) 出現非特異性PCR產(chan) 物吸附，引起本底偏高的現象。

第二類PCR-ELISA為(wei) 生物素和地穀新分別標記PCR擴增產(chan) 物和核苷酸探針。用生物素化的引物進行PCR擴增，然後加入親(qin) 和素包被的酶標板中，冰浴1h，經洗滌後加入變性劑（50mmol/L NaOH)室溫作用數分鍾，加入雜交液和地穀新標記的探針，雜交完成經洗滌後加入堿性磷酸酶標記的抗地穀新抗體(ti) ，室溫下作用1h經充分洗滌後加顯色劑，讀取A值。該方法利用生物素化引物獲得含生物素的PCR產(chan) 物，使產(chan) 物能與(yu) 包被在酶標板上的親(qin) 和素牢固地結合，使特異性PCR擴增產(chan) 物吸附於(yu) 酶標板上，繼而用地穀新標記的探針進行雜交和放大，這一方法特異性強，靈敏度高，重複性好。

PCR-ELISA方法的*性主要表現在以下四個(ge) 方麵。①利用生物素-親(qin) 和素係統的強大親(qin) 和能力，其親(qin) 和常數K約為(wei) 抗原抗體(ti) 的104~107倍，為(wei) A蛋白（SPA)對IgF。的108倍。生物素和親(qin) 和素二者高度特異的快速結合，不易受外界幹擾，複合物十分穩定，極少發生離解，提高了實驗的穩定性，縮短了反應時間。此外，親(qin) 和素不含糖基，等電點為(wei) pH=6.0，與(yu) 其他抗原或抗體(ti) 包被酶標板比較，其非特異性吸附顯著減少，靈敏度得到提高。②PCR擴增使陽性信號通過擴增本身以及地穀新抗原抗體(ti) 反應得到極大程度的放大，從(cong) 而使檢測的靈敏度進一步提高。③PCR-ELISA中尿嘧啶核苷酸轉移酶的使用，使PCR技術中交叉汙染得以極大程度的控製而不影響檢測效果，基本克服了PCR雜交技術中由於(yu) 汙染造成的假陽性問題。④標記探針的使用，使檢測的特異性進一步提高，可以與(yu) 放射性標記的Southern雜交相媲美，且探針的引進使其應用的範圍增大，比PCR本身在基因多態性分析、病毒分型、克隆鑒定等方麵顯示了其*的優(you) 勢。另外，非同位素標記係統的應用又避免了使用同位素帶來的危害，而且整個(ge) 實驗周期較Southern雜交明顯縮短（約 6h），並且操作簡便，可用於(yu) 大批量標本的同時檢測。當然PCR-ELISA方法的建立有一定的要求，其中PCR產(chan) 物和探針的雜交條件（PCR產(chan) 物的稀釋度、雜交溫度和時間）與(yu) 檢測敏感性、特異性有密切關(guan) 係。

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