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ELISA原理實驗條件和技術要點
點擊次數:1515 更新時間:2011-06-02

 

在應用ELISA時,首先要清楚下麵內(nei) 容:1,是檢測抗體(ti) 還是抗原?2,檢測的結果是定性還是定量?3,是否需要檢測特異抗體(ti) 的類型?4,所用抗體(ti) /單克隆抗體(ti) 的親(qin) 和力怎樣?

(1)檢測抗原  zui常用於(yu) 檢測抗原的方法是非競爭(zheng) 性的雙抗體(ti) 夾心法,其次是競爭(zheng) 法。但競爭(zheng) 法在具體(ti) 實驗中有些困難,特別是檢測微生物的抗原,因為(wei) 需要標記抗原,這對於(yu) 某些抗原是很難做到的,甚至是不可能的。另外在競爭(zheng) 法中,酶標記的抗原與(yu) 標本直接混合在一起,許多標本中含有酶抑製劑或蛋白A樣物質,可影響的結果。

(2)檢測抗體(ti)   檢測抗體(ti) 種類常用的方法是檢測抗體(ti) 種類的捕獲法,這個(ge) 方法常用於(yu) 檢測特異性IgGIgAIgM.。這個(ge) 方法的*步是捕獲所需要檢測的一個(ge) 種類的抗體(ti) ,接下來是檢測捕獲的抗體(ti) 是否是特異性抗原的抗體(ti) 。間接ELISA在檢測IgG時比較簡單,但不適用於(yu) 檢測其他種類的抗體(ti) ,因為(wei) 血清中如果有特異IgG存在將與(yu) IgMIgA等競爭(zheng) 結合抗原。

競爭(zheng) 法檢測抗體(ti) 有兩(liang) 種方法:一種是將標記的抗體(ti) 和標本同時加入反應孔內(nei) ,但標記的抗體(ti) 和標本中的抗體(ti) 必須是結合抗原的不同決(jue) 定簇;另一種是先加標本,衝(chong) 洗後再加標記的抗體(ti) 。競爭(zheng) 法檢測抗體(ti) 比間接法容易判斷結果,並且比較敏感和特異。不論選擇哪種方法,ELISA都包括6個(ge) 步驟:1,抗原或抗體(ti) 吸附於(yu) 固相;2.加標本和試劑;3,孵育和衝(chong) 洗;4,加酶標抗原或抗體(ti) ;5,加適當的底物;6,檢測和分析結果。

雖然ELISA法在理論上十分簡單,但每一步都有要注意的事項。不論是新設計的ELISA還是沿用其他ELISA方法都有以下幾方麵技術要點:固相載體(ti) 的選擇和試劑的製備,反反應條件和操作的標準化。