氯黴素

快速檢測試劑盒說明書(shu)

一、原理

本試劑盒采用間接競爭(zheng) ELISA方法，在微孔條上預包被偶聯抗原，樣本中的殘留物氯黴素將和微孔條上預包被的偶聯抗原競爭(zheng) 抗氯黴素抗體(ti) ，加入酶標記物後，用TMB底物顯色，樣本吸光值與(yu) 其所含殘留物氯黴素的含量成負相關(guan) ，與(yu) 標準曲線比較即可得出相應殘留物氯黴素的含量。

二、試劑盒特性

• 試劑盒靈敏度：   0.02ppb
• 孵育溫度：       25℃
• 孵育時間：       30min～15min
• 樣本檢測限

組織、蜂蜜、牛奶···································· 0.1ppb

奶粉、蛋類、尿樣、飼料··························· 0.15ppb

• 交叉反應率

氯黴素 ·············································· 100%

甲碸黴素 ········································· < 0.1%

氟甲碸黴素 ······································ < 0.1%

• 樣本回收率

組織、蛋類、奶粉·····························  85%±20%

蜂蜜、牛奶、飼料·····························  93%±25%

尿樣··········································  100%±25%

三、試劑盒組成

四、所用儀(yi) 器、試劑

具備的儀(yi) 器：酶標儀(yi) 、均質器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）、氮吹儀(yi) 、恒溫箱

微量移液器：單道 20～200µl、單道100～1000µl、多道 30～300 µl

試      劑：乙酸乙酯、正己烷

五、樣本前處理步驟

• 樣本處理前須知

（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。

（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否幹淨，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免汙染幹擾實驗結果。

• 樣本前處理需配製：

配液1  樣本複溶液：

將2X濃縮複溶液用去離子水按1：1稀釋。

• 樣本處理：

（a）肌肉組織樣本處理方法

• 稱取均質後的新鮮樣本3±0.05g於50ml離心管中，加入3ml去離子水後再加入6ml乙酸乙酯，振蕩1min，室溫4000r/min以上離心10min；
• 取出4ml上層液體在50-60℃氮氣流中吹幹； 
• 加入1 ml正己烷溶解幹燥的殘留物，再加1ml樣本複溶液混合30s，室溫4000r/min以上離心10min；去除上層有機相；
• 取50 µl下層相用於分析。

樣本稀釋倍數:  0.5倍 

此方法無法檢測肝髒類樣本，處理時易出現乳化現象，影響檢測結果(乳化時建議處理方法：去除上層有機相再加入2ml正己烷混合30s，室溫4000r/min以上離心10min；去除上層有機相)。

（b）蜂蜜處理方法

• 稱取2±0.05 g蜂蜜，放入離心管中，用2ml去離子水溶解；加入6ml乙酸乙酯振蕩1min，室溫4000r/min以上離心10min；
• 移取3ml上層清澈液到另一離心管中，50-60℃氮氣流下幹燥；用0.5ml樣本複溶液溶解幹燥的殘留物，混合30s；
• 取50 µl用於分析。

樣本稀釋倍數：  0.5倍  

（c）牛奶、奶粉、蛋類樣本處理方法

• 稱取均質後的新鮮樣本2±0.05g（或2ml）於50ml離心管中，加入6ml乙酸乙酯，振蕩1min，室溫4000r/min以上離心10min；
• 取出3ml上層液體在50-60℃氮氣流中吹幹； 
• 加入1 ml正己烷溶解幹燥的殘留物，再加1ml樣本複溶液混合30s，室溫4000r/min以上離心10min；去除上層有機相；
• 取50 µl下層相用於分析。

樣本稀釋倍數:  1倍 

處理時如無法取到3ml上層液體(ti) ，可以重複離心後再取液，或加入10ml乙酸乙酯後取5ml吹幹，稀釋倍數不變。

（d）尿樣、飼料樣本處理方法

• 稱取均質後的新鮮樣本1±0.05g（或1ml）於50ml離心管中，加入6ml乙酸乙酯，振蕩1min，室溫4000r/min以上離心10min；
• 取出3ml上層液體在50-60℃氮氣流中吹幹； 
• 加入1 ml正己烷溶解幹燥的殘留物，再加1ml樣本複溶液混合30s，室溫4000r/min以上離心10min；去除上層有機相；
• 取50 µl下層相用於分析。

樣本稀釋倍數:  2倍 

六、 酶標免疫分析程序:

• 測定前應須知：

• 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20～25℃）。
• 使用之後立即將所有試劑放回2～8℃。
• 在ELISA分析中的再現性，很大程度上取決於洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。
• 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。

• 操作步驟：

• 從2～8℃冷藏環境中取出所需試劑，室溫（20～25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
• 取出框架及需要數量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存於2-8℃。
• 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配製洗滌液。
• 編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，並記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
• 加標準品/樣本50µl/孔到各自的微孔中，然後加入酶標記物50µl/孔，後加入抗體工作液50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻。25℃環境中反應30min。
• 將孔內液體甩幹，用已稀釋的洗滌液250µl/孔洗板4～5次，每次間隔15～30秒，用吸水紙拍幹（拍幹後未清除的氣泡可用幹淨的槍頭刺破）。
• 顯色：加入底物A液50µl/孔，再加入底物B液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環境中避光顯色15min。
• 測定：加入終止液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀於450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，5min內讀數），測定每孔OD值。

七、結果判定

結果判定有兩(liang) 種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與(yu) 其所含氯黴素量成負相關(guan) 。

1、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與(yu) 標準值比較即可得出其濃度範圍(ng/ml)。假設樣本1的吸光度值為(wei) 0.3，樣本2的吸光度值為(wei) 1.0，標準液吸光度值分別是：0ppb為(wei) 2.143； 0.02ppb為(wei) 1.816；0.06ppb為(wei) 1.415；0.18ppb為(wei) 0.74；0.54ppb為(wei) 0.313；1.62ppb為(wei) 0.155。則樣本1的濃度範圍是0.54ppb～1.62ppb；樣本2的濃度範圍是0.06ppb～0.18ppb，乘以其對應的稀釋倍數即為(wei) 樣本中氯黴素實際濃度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等於(yu) 標準品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以di一個(ge) 標準（0標準）的吸光度值，再乘以100%，即

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值

（2）標準曲線的繪製與(yu) 計算

以標準品百分吸光率為(wei) 縱坐標，以氯黴素標準品濃度（ng/ml）的半對數為(wei) 橫坐標，繪製標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從(cong) 標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為(wei) 樣本中氯黴素實際濃度。

若利用試劑盒專(zhuan) 業(ye) 分析軟件進行計算，更便於(yu) 大量樣本的準確、快速分析。（歡迎索取）

八、 注意事項

• 室溫低於25℃或試劑及標本未回到室溫（20～25℃）會導致所有標準的OD值偏低。
• 在洗板過程中如果出現板孔幹燥的情況，則會伴隨著標準曲線不成線性，重複性不好的現象。所以洗板拍幹後應立即進行下一步操作。
• 混合要均勻，否則會出現重複性不好的現象。
• 反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
• 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。
• 不用的微孔板放進自封袋重新密封；標準物質和無色的發色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
• 顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。標準品1的吸光度值小於0.5時，表示試劑可能變質。
• 該試劑盒zui佳反應溫度為25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。

九、儲(chu) 藏條件和保質期

• 儲藏條件：試劑盒於2-8℃保存，不要冷凍。
• 保 質 期：該產品有效期為1年，生產日期見包裝盒。

提示：酶標板真空包裝袋若有漏氣，酶標板仍然正常有效，不影響實驗結果，請放心使用。