口蹄疫病毒（通用型）檢測試劑盒（實時熒光PCR法）說明書(shu)

【產(chan) 品名稱】

通用名稱：口蹄疫病毒（通用型）檢測試劑盒（實時熒光PCR法）

英文名稱：Foot and Mouth Disease Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規格】 25T/盒 & 50T/盒

【預期用途】

口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus，FMDV) 屬於(yu) 小RNA病毒科，口蹄疫病毒屬，主要侵害偶蹄獸(shou) ，有O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia-I七個(ge) 血清型。口蹄疫發病以發熱、口腔黏膜及蹄部和乳房皮膚發生水泡和潰爛為(wei) 特征，是獸(shou) 疫局規定的A類傳(chuan) 染病，易通過空氣傳(chuan) 播，傳(chuan) 染性強，流行迅速，偶爾感染人。由於(yu) 口蹄疫傳(chuan) 播迅速、難於(yu) 防治、補救措施少，被稱為(wei) 畜牧業(ye) 的“*殺手”。

本試劑盒利用實時熒光PCR原理，定性檢測口蹄疫通用型病毒，對口蹄疫病毒引起的偶蹄獸(shou) 類病的診斷和監控具有重要指導意義(yi) 。                                        

【檢驗原理】

本試劑盒針對口蹄疫病毒通用型的高度保守區域設計特異性引物和探針，在反應體(ti) 係中含口蹄疫病毒通用型基因組模板的情況下，PCR反應得以進行並釋放熒光信號。利用熒光定量PCR儀(yi) 對PCR過程中相應通道信號進行實時監測和輸出，實現檢測結果的定性分析。

【主要組成成份】

注：陰性對照為(wei) 偶蹄獸(shou) 類基因組DNA，陽性對照為(wei) 失去活性的口蹄疫病毒cDNA。

【儲(chu) 存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反複凍融，有效期12個(ge) 月。

【適用儀(yi) 器】ABI 係列、Bio-Rad係列、Agilent Stratagene MX係列、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene係列、杭州博日係列、湖南潤美係列等多通道實時熒光定量PCR儀(yi) 。

【樣本要求】

新鮮采集的咽拭子、皰疹液和糞便標本，並使用滅菌生理鹽水懸浮。

2.應避免標本間交叉汙染。

3.標本收集後可立即檢測；若不能立即檢測，可置於(yu) 2～8℃冷藏過夜保存；如需長期保存，標本應凍存於(yu) -80℃以下，避免反複凍融。

【檢驗方法】

1. 試劑準備（試劑準備區）

（1）從(cong) 冰箱中取出試劑盒, 從(cong) 試劑盒中取出實驗所需試劑，充分融化混勻並瞬時離心以去除管壁附著液體(ti) 。

（2）核算當次實驗所需要的反應數（n），並根據如下表所示反應體(ti) 係計算當次實驗所需要的各種試劑量。

n =陰性對照數（1T）+陽性對照數（1T）+誤差預留量（1T）+樣本數

 (3)在無菌離心管中加入上述試劑，充分混勻後瞬時離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應管。

2.樣本準備（樣本處理區）

用本公司病毒核酸提取試劑盒提取RNA，具體(ti) 操作按照其試劑盒說明書(shu) 操作。

3.加樣

在上述製備好的PCR反應樣本管中分別加入處理好的待測標本RNA各5 μL、終體(ti) 積25 μL/管，蓋好PCR反應管蓋，混勻後瞬時低速離心，轉移到PCR儀(yi) 器上。陰性對照和陽性對照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品，終體(ti) 積為(wei) 25 μL/管，蓋好PCR反應管蓋，混勻後瞬時低速離心，轉移到PCR儀(yi) 器上。

4. PCR（PCR擴增區）

（1）取樣本處理區準備好的PCR反應管，放置在實時熒光定量PCR儀(yi) 樣品槽相應位置，並記錄放置順序。

（2）按下表設置儀(yi) 器核酸擴增相關(guan) 參數進行PCR擴增。

注：ABI係列熒光PCR儀(yi) 在設置時不選ROX校正，設置淬滅基團選擇None。

【陽性判斷值或者參考區間】

1.試劑盒有效性判定：

 （1）陽性對照：有典型S型擴增曲線或Ct值≤35。

 （2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值，線形為(wei) 直線或輕微斜線，無指數增長期。

2.標本結果判定：

（1）陽性：標本檢測結果Ct值≤35或有明顯指數增長期。

（2）可疑：標本檢測結果Ct值在35～38範圍內(nei) 。此時應對標本進行重複檢測，如重複實驗結果Ct值仍在35～38範圍內(nei) ，有明顯指數增長期，則判定為(wei) 陽性，否則為(wei) 陰性。

（3）陰性：標本檢測結果Ct值＞38或無Ct值。

【檢驗結果的解釋】

【檢驗方法的局限性】

• 當檢測樣本中被檢核酸濃度低於本試劑盒的低檢出*可能會發生假陰性的結果。
• 被檢樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中操作方式不當容易造成RNA降解而產生假陰性結果。
• 樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中發生交叉汙染，則容易得到假陽性結果。

【產(chan) 品性能指標】 產(chan) 品的低檢出限為(wei) 10² Copies/mL，產(chan) 品CV值≤5%。

【注意事項】

• 整個檢測過程應嚴格按照本說明書要求分別在試劑準備區、樣本處理區和PCR擴增區進行操作，各區實驗服、儀器、耗材應獨立使用，不能混用；實驗用吸頭采用帶濾芯吸頭；樣本處理區應配有生物安全櫃，樣本處理在生物安全櫃中進行操作；三個區應該配有紫外線殺菌裝置。
• 為避免RNA降解，樣本處理過程應在0-4℃條件下操作，且完成實驗後立即上機檢測；樣本處理過程中使用的器具耗材應經過無核酶處理。
• 每次實驗應該設置陰、陽性對照。
• 試劑盒所有試劑在使用前應該在常溫下充分融化混勻，並應瞬時離心。
• 試劑盒內所配陰性和陽性對照在di一次使用前應全部轉移至標本準備區，並單獨存放。
• 為防止熒光幹擾，應避免裸手直接接觸PCR反應管，並應避免在PCR反應管上進行任何標記。
• 儀器擴增相關參數應按照本說明書相關要求進行設置；不同批號試劑不能混用。
• ABI係列熒光定量PCR儀參數設置中不選ROX校正，淬滅基因選擇None。
• 實驗過程中產品的廢棄物應該進行無害化處理後方可丟棄。