考馬斯亮藍法測蛋白含量測定試劑盒說明書(shu)

可見分光光度法

注意：正式測定之前選擇2-3個(ge) 預期差異大的樣本做預測定，

確保蛋白濃度在0~1000µg/ml範圍內(nei) 。

測定意義(yi)

樣品可溶性蛋白質含量常常用於(yu) 酶活性計算。此外，可溶性蛋白質含量也用於(yu) 食品等質量分析。

測定原理

在酸性溶液中，考馬斯亮藍G-250與(yu) 蛋白質結合形成藍色複合物；該複合物在595nm處有大吸收峰， 其顏色的深淺與(yu) 蛋白質的濃度成正比。該方法靈敏度高，適合微量蛋白質分析。

自備儀(yi) 器和用品

離心機、可見分光光度計、移液器、1mL玻璃比色皿和蒸餾水。

試劑組成和配製

試劑一：液體(ti) ×1 瓶，4℃保存。

標準品：液體(ti) ×1 瓶，4℃保存。

樣品中可溶性蛋白質提取

1. 液體(ti) 樣品：澄清無色液體(ti) 樣品可以直接測定。

2. 組織樣品：按照組織質量（g）：提取液體(ti) 積(mL)為(wei) 1：5~10的比例（建議稱取約 0.1g組織，加入1mL提取液（自備，根據需要選用酶提取緩衝(chong) 液或者蒸餾水或者生理鹽水）冰浴勻漿，8000g，4℃離心10min，取上清，即待測液。（動物樣品常常需要稀釋）

3. 細菌、真菌：按照細胞數量（10⁴個(ge) ）：提取液體(ti) 積（mL）為(wei) 500~1000：1的比例（建議500萬(wan) 細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間 3min）；然後 8000g，4℃，離心 10min，取上清置於(yu) 冰上待測。

測定操作：

1. 分光光度計預熱30min，蒸餾水調零。

2. 空白管：取1mL玻璃比色皿，加入200μL蒸餾水，1000μL試劑一，混勻後室溫靜置10min，

於(yu) 595nm比色，10~20min 完成比色，記為(wei) A空白管。

3. 標準管：取1mL玻璃比色皿，加入200μL標準液，1000μL試劑一，混勻後室溫靜置10min，

於(yu) 595nm比色，10~20min 完成比色，記為(wei) A標準管。

4. 測定管：取1mL玻璃比色皿，加入200μL待測液，1000μL試劑一，混勻後室溫靜置10min，

於(yu) 595nm比色，10~20min完成比色，記為(wei) A測定管。

注意：空白管和標準管隻需要測定一次。

計算公式:

Cpr（µg/mL）= C標準管×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)

=50×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標準管－A 空白管)

C 標準管：標準品蛋白質濃度，50μg/mL。

注意事項：

1.加考馬斯亮藍後，在10~20min 內(nei) 吸光值相對較穩定，因此須在10~20min 完成比色。

2.不宜用石英比色皿，可用玻璃或塑料比色皿，測完成後立即用 95%乙醇衝(chong) 洗。

3.測定前用1~2個(ge) 樣做預實驗，確保蛋白濃度在0~1000µg/ml 範圍內(nei) ，否則需要做相應稀釋，使得稀釋後的結果在 0~1000µg/ml 範圍內(nei) ，然後再乘以稀釋倍數。