高靈敏度化學發光檢測試劑盒說明書(shu)

eECL Western Blot Kit

目錄號：YJ0049

保存條件：2-8℃避光保存。

組分說明

                 Catalog no.      YJ0049B     YJ0049C

                 Volume             50 ml       250 ml

                 增強型發光劑             25 ml       125 ml

                 穩定劑                25 ml       125 ml

本產(chan) 品僅(jin) 供科研使用，請勿用於(yu) 臨(lin) 床診斷及其他用途產(chan) 品簡介

　　高靈敏度化學發光檢測試劑盒是免疫印跡實驗中與(yu) 辣根過氧化物酶（HRP）配套使

用的的高靈敏增強型檢測試劑盒。該產(chan) 品基於(yu) 新一代增強型化學發光底物研製而成，在

HRP的催化下產(chan) 生高強度的信號，能夠檢測pg級別的抗原。靈敏度高、發光信號強烈

持久，可以使用照相技術（X-光膠片曝光）或者其他成像方法（如熒光或化學發光成像

儀(yi) ）進行檢測。

注意事項

1. 為(wei) 獲得佳實驗結果，請務必優(you) 化實驗條件，包括檢測樣品的用量、一抗、二抗稀

   釋度、雜交膜及封閉試劑的選擇，抗體(ti) 孵育及膜洗滌步驟中請使用搖床輔助完成。

2. 由於(yu) 奶粉中含有內(nei) 源性生物素，在使用親(qin) 和素/生物素係統時，封閉液中應避免使用

   奶粉。

3. 免疫印跡實驗進行全過程中，使用充足的洗滌緩衝(chong) 液、封閉液、抗體(ti) 稀釋液和底物

   反應液以*覆蓋印跡，確保印跡膜始終處於(yu) 濕潤狀態，避免幹燥。使用大量的封

   閉液和洗滌液，可以降低非特異信號。

4. 由於(yu) 疊氮鈉是HRP抑製劑，在緩衝(chong) 液中應避免使用疊氮鈉作為(wei) 防腐劑。

5. 在與(yu) 膜發生接觸過程中，請佩戴手套且使用幹淨鑷子等潔淨器材，避免蛋白汙染及

   高背景。

6. 避光條件下，配製好的化學發光檢測底物工作液可在室溫下穩定保存8小時。陽光

   或其他強光會(hui) 影響工作液，故應避免強光長時間的照射。正常實驗室燈光短時間照

   射不影響工作液的使用。

7. 上海研謹生物提供多種蛋白轉移用膜、封閉液、一抗、酶標二抗、緩衝(chong) 液等，詳情請查

   詢目錄或網站。

操作步驟

注意：務必使用推薦的抗體(ti) 稀釋濃度以獲得陽性結果，佳抗原和抗體(ti) 用量須通過預

實驗來確定。

1．二抗孵育完畢後，將印跡膜充分洗滌。

2．根據需要量，將增強型發光劑和穩定劑按照1：1的比例等體(ti) 積混合，配製為(wei) 化學發

   光檢測底物工作液（例如：一張8 cm×6 cm的膜使用1 ml工作液）。

3．棄去洗滌緩衝(chong) 液，將發光底物工作液滴加在印跡膜上，確保工作液覆蓋整張膜，室

   溫孵育3-5分鍾。

4．用移液器吸去多餘(yu) 發光底物工作液，將印跡膜置於(yu) 兩(liang) 層幹淨的塑料薄膜之間，此過

   程應小心完成，避免膜與(yu) 膜之間產(chan) 生氣泡。

5．在暗室內(nei) 進行X-光膠片曝光，或將膜放置到熒光、化學發光成像儀(yi) 內(nei) ，按照儀(yi) 器說

   明書(shu) 進行檢測。

   注意：一抗推薦用量為(wei) 50 ng/ml-1 μg/ml，二抗推薦用量為(wei) 5 ng/ml-50 ng/ml。

相關(guan) 實驗材料

YJ0043  TBST(TBS with Tween-20，pH8.0)            YJ0058  NC膜(0.45μm)

YJ0052  蛋白示蹤上樣緩衝(chong) 液（還原）                YJ2002  NC膜(0.22μm)

YJ0053  蛋白示蹤上樣緩衝(chong) 液（非還原）               YJ0059  PVDF膜(0.45μm)

YJ0054  WB封閉液I（BSA）                        YJ2003  PVDF膜(0.22μm)

YJ0055  WB封閉液II（奶粉）                        YJ0060  X線暗盒

YJ0056  蛋白印跡膜再生液                            YJ0061  X光膠片

YJ0057  麗(li) 春紅染色液                                YJ0062  定影粉

YJ0044  Tris Glycine轉膜緩衝(chong) 液                        YJ0063  顯影粉

 常見問題解答

問題                        

1.膠片反相（白色條帶，黑色背景）

2.膜上出現棕色或黃色條帶

3.暗室中看到強烈發光

4.發光信號持續時間過短

可能原因： 係統中HRP過量                     

解決(jue) 方法：稀釋HRP標記物至少10倍以上

問題：信號較弱或者無信號

可能原因：

a發光反應係統中HRP過多，消耗稀釋底物過快，引起信號迅速降低

b抗原/抗體(ti) 量不夠

c蛋白轉移率低

解決(jue) 方法：

a稀釋HRP 標記物至少10倍以上

b增加抗原/抗體(ti) 使用量

c優(you) 化轉移係統

問題：高背景

可能原因：

a係統中HRP過量

b 封閉不足

c 封閉試劑選擇不當

d 衝(chong) 洗不充分

e曝光過度

f抗原/抗體(ti) 濃度過高   

解決(jue) 方法：

a稀釋HRP標記物至少10倍以上

b優(you) 化封閉程序

c選擇另一種封閉試劑

d增加衝(chong) 洗時間，次數

e減少曝光時間

f降低抗原/抗體(ti) 使用濃度

問題：蛋白條帶為(wei) 點狀

可能原因：

a蛋白轉移失敗

b膜未平衡                       

c膠片與(yu) 膜之間有氣泡                               

解決(jue) 方法：

a優(you) 化轉移過程

b按照說明書(shu) 處理膜

C曝光前去除所有氣泡

問題：出現非特異條帶 （高背景、信號維持時間較短）

可能原因：係統中HRP過多   

解決(jue) 方法：稀釋HRP標記物

問題： 出現非特異條帶（背景幹淨信號維持時間正常）

可能原因：

1. 一抗用量過多                                  

2. SDS導致非特異結合

解決(jue) 方法：

1.進一步稀釋一抗

2. 在實驗過程中避免使用SDS

      使用本產(chan) 品的文獻

      Lu X, Zhang N, Meng B, et al. Involvement of GPR12 in the regulation of cell proliferation and survival. Mol Cell

      Biochem. 2012 Mar 20

      He J, Kang L, Wu T, et al. An elaborate regulation of mTOR activity is required for somatic cell reprogramming

      induced by defined transcription factors. Stem Cells Dev. 2012 Apr 3

      Lu X, Zhang N, Dong S, et al. Involvement of GPR12 in the induction of neurite outgrowth in PC12 cells. Brain

      Res Bull. 2012 Jan 4;87(1):30-6.