pBM16A Toposmart Cloning Kit

保存條件：-20℃保存，有效期一年。產(chan) 品介紹：

pBM16A Toposmart克隆試劑盒利用痘苗病毒的拓撲異構酶I(Topoisomerase I)的切割再連接的特點將片段克隆到載體(ti) 中。不僅(jin) 適用於(yu) 克隆由Pfu、KOD、Xerox、Phusion 和Q5等高保真DNA聚合酶擴增的平末端PCR產(chan) 物，也可克隆由Taq、Tth和klenTaq等DNA聚合酶擴增的帶A尾的PCR產(chan) 物。試劑盒中的pBM16A載體(ti) 為(wei) 線性化的質粒。可以用引物對M13F和M13R進行菌落PCR鑒定陽性克隆。

產品特點：

（1）連接反應僅(jin) 需 5 分鍾。

（2）適用於(yu) 平末端PCR產(chan) 物和帶A尾的PCR產(chan) 物。

（3）載體(ti) 采用了新的製備工藝，無需藍白斑篩選。

1. 克隆位點兩旁都有Smal和EcoR V酶切位點，適合單酶切鑒定。
2. 載體具有氨苄青黴素抗性。

操作步驟：

1. 連接反應

按下表，在一個(ge) 0.2ml PCR 管中依次加入

 加完試劑後，輕輕混勻低速離心，使溶液集中在管底。

注意：此步驟不要在低溫條件下（冰水浴）上操作。

2. 反應溫度及片段要求

室溫下（20-30℃）放置 0-5 分鍾，然後將離心管放置在冰上。如當天不進行轉化實驗。請將連接產(chan) 物置於(yu) -20℃保存。

注意：DNA-- 片段的用量見下表

室溫下（20-30℃）反應時間 5-30 分鍾，如果室溫較低，推薦使用 PCR 儀(yi) 器控製溫度。可以設置 25℃反應 5 分鍾。如果 PCR 產(chan) 物電泳檢測僅(jin) 有很銳利明亮的條帶，無引物二聚體(ti) 和非特異性條帶存在，可直接取 0.5-1µl PCR 產(chan) 物原液進行克隆。

3. 陽性對照反應

取 1µl 試劑盒提供的 1kb 長度的對照片段 LacZ 基因α肽片段進行克隆，轉化具有α 互補功能的大腸杆菌感受態細胞（如 DH5α,*0,Mach1-T1 等）。菌液塗布在含有IPTG,X-gal 的 LB 氨苄平板上，次日藍色菌落為(wei) 陽性克隆，說明有片段插入，白色菌落為(wei) 空載體(ti) 。

4. 轉化

1.取 5µl 連接產(chan) 物到 50-100µl 剛剛融化的感受態細胞中，輕輕混勻，冰浴 2-30 分鍾。

2.42℃水浴中熱擊 30 秒鍾。

3. 立刻置於(yu) 冰水浴中 2 分鍾。

加入 300-500µl 無菌的不含抗生素的 SOC 或LB，37℃，200-250rpm 振蕩培養(yang) 60 分鍾。

注：小於 2kb 片段可以不複蘇，直接塗平板。

• 吸取 200µl 菌液塗布。為了得到更多的菌落，可以先 4000rpm 離心 1 分鍾，去掉部分上清，用移液器輕吹菌體，充分懸浮菌液，取全部菌液塗布，然後 37℃培養過夜（12-16 小時）。

5. 陽性重組子的鑒定菌落 PCR

（1） 菌落PCR方法鑒定陽性克隆

① 用10ml吸頭挑選克隆至預先加有10μl無菌水或LB培養(yang) 基的PCR管中，吹打混合。

② 25ml PCR反應體(ti) 係：取2μl細菌懸液為(wei) 模板、加入5μM 濃度的M13F/M13R各

1μl進行PCR擴增。

③PCR擴增條件：95℃預變性5分鍾（裂解細胞，失活核酸酶），94℃變性10秒鍾，55℃退火10秒鍾，72℃延伸（ 根據片段的大小決(jue) 定延伸時間，通常每1min/1kb）X秒，30個(ge) 循環，72℃後延伸5分鍾。1%瓊脂糖凝膠電泳分析擴增結果，有強烈的明顯條帶的克隆為(wei) 重組體(ti) ，與(yu) 插入片段大小相近（M13F/M13R 引物在克隆位置的兩(liang) 側(ce) ，所以PCR擴增出的DNA的長度比插入片段大138bp） 可視為(wei) 陽性克隆。菌落PCR方法鑒定重組子時一定要設立一個(ge) 不加菌液的陰性對照。

（2） 測序：用M13F、M13R通用引物對陽性質粒進行測序分析。

pBM16A載體(ti) 圖譜

常見問題分析

重組子克隆菌少，或陽性率低：

(1) 感受態效率低，使用轉化效率>5×107cfu/µg 的感受態細胞

(2) 連接反應在低溫下（如放碎冰上）操作，應該在室溫下操作。

(3) PCR 片段加入量太多或太少，按照推薦量加入。

(4) PCR 純度低，重新擴增或重新純化PCR 產(chan) 物。

(5) PCR 質量低，切膠時在紫外下照射時間長，需重新製備。

(6) PCR 擴增結束後，應該再延伸 5-10 分鍾，確保片段延伸*。

(7) 轉化後沒有複蘇培養(yang) ，可以加入 SOC 或LB，培養(yang) 60 分鍾。

• 克隆基因可能對宿主菌有毒性，比如某些編碼膜蛋白和 DNA 結合蛋白的基因， 某些啟動子和調節序列基因，或含有倒置或串聯重複序列的基因，選用室溫過夜培養平板。

載體序列：

>pBM16A Topo AGTGAGTTGATTGTGTAAAACGACGGCCAGTGTCTGAGGCTCGCTTCAGTCCTGATGCTTGATATCCCGGGCGT GTCGCCCTT$$$$AAGGGCGACACGCCCGGGATATCGCGTCTGCCTGAAGTCAATACTGACGATGGTCATAGCT GTTTCCTGTCCATAGCAGAAAGTCAAAAGCCTCCGACCGGAGGCTTTTGACTTGATCGGCACGTAAGAGGTTCC AACTTTCACCATAATGAAATAAGATCACTACCGGGCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGA AGCTAAAATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCACTTATTCCGTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTG CTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTG GATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGT TCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTC AGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGC AGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCT AACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCA TACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAA CTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCG CTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGCTCTCGCGGTATCATTG CAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGAT GAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAATGAGGGCCCAAATGTAATCA CCTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATC ACAAAAATCGATGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGA AGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAG CGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTG TGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGA CACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGA GTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAG TTACCTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTT GCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATTTTCTACCGAAGAAAGGCCCAC CCGTGAAGGTGAGCC

本產(chan) 品僅(jin) 供研究不用於(yu) 臨(lin) 床診斷