琥珀酸脫氫酶（Succinate Dehydrogenase，SDH）試劑盒說明書(shu)

微量法

正式測定前務必取2-3個(ge) 預期差異較大的樣本做預測定

測定意義(yi)

SDH（EC 1.3.5.1）廣泛存在於(yu) 動物、植物、微生物和培養(yang) 細胞中。SDH是線粒體(ti) 的一種標誌酶，位於(yu) 線粒體(ti) 內(nei) 膜上的一種膜結合酶，是連接呼吸電子傳(chuan) 遞和氧化磷酸化的樞紐之一。

此外，為(wei) 多種原核細胞產(chan) 能的呼吸鏈提供電子。

測定原理

SDH 催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸，脫下的氫通過吩嗪二甲酯硫酸（PMS）傳(chuan) 遞還原2,6-

二氯酚靛酚（DCPIP），並且在600nm 處具有特征吸收峰，通過600nm吸光度的變化，測定2．6-DPIP 的還原速度，代表SDH 酶活性。

需自備的儀(yi) 器和用品

可見分光光度計/酶標儀(yi) 、水浴鍋、台式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配製

試劑一：100mL×1 瓶，-20℃保存；

試劑二：20mL×1 瓶，-20℃保存；

試劑三：1.5mL×1 支，-20℃保存；

試劑四：粉劑×1 瓶，4℃保存；

試劑五：粉劑×1 支，-20℃保存；

樣本的前處理

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與(yu) 線粒體(ti) 蛋白的分離：

1、稱取約0.1g組織或收集500萬(wan) 細胞，加入1mL試劑一和10uL試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、將勻漿600g，4℃離心5min。

3、棄沉澱，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。

4、上清液即胞漿提取物，可用於(yu) 測定從(cong) 線粒體(ti) 泄漏的SDH（此步可選做）。

5、 在步驟④的沉澱中加入200uL試劑二和2uL試劑三，超聲波破碎, 冰浴，功率20％或200W，超聲3秒，間隔10秒，重複30次），用於(yu) 線粒體(ti) SDH活性測定。

測定步驟和加樣表

1、分光光度計或酶標儀(yi) 預熱30min以上，調節波長至600nm，蒸餾水調零。

2、樣本測定

（1）在試劑四中加入18mL蒸餾水充分溶解，置於(yu) 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴10min；用不完的試劑4℃保存一周；

（2）在試劑五中加入1mL蒸餾水，充分溶解待用；用不完的試劑 4℃保存一周；

（3）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑五和180μL試劑四，混勻，立即記錄600nm處20s時的吸光值 A1和1min20s後的吸光值A2，計算ΔA=A1-A2。

SDH 活性的計算

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義(yi) ：每mg組織蛋白每分鍾消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活性單位。

SDH 活性（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V 樣) ÷T

=952×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算

單位的定義(yi) ：每g組織每分鍾消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活性單位。

SDH 活性（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W×V樣÷V樣總) ÷T=192×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算

單位的定義(yi) ：每1萬(wan) 個(ge) 細菌或細胞每分鍾消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活性單位。

SDH 活性（nmol/min/10⁴cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.385×ΔA

V 反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，2×10 ^-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光係數，2.1×10 ⁴ L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體(ti) 積，0.01 mL；V 樣總：加入提取液體(ti) 積，0.202 mL；T：反應時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500 萬(wan) 。

b.用96孔板測定的計算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義(yi) ：每mg組織蛋白每分鍾消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活性單位。

SDH 活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=1904×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算

單位的定義(yi) ：每g組織每分鍾消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活性單位。

SDH 活性（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=384×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算

單位的定義(yi) ：每1萬(wan) 個(ge) 細菌或細胞每分鍾消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活性單位。

SDH 活性（nmol/min/10⁴cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.77×ΔA

V 反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，2×10 ^-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光係數，2.1×10⁴ L/mol/cm；d：96 孔板光徑，0.5cm；V 樣：加入樣本體(ti) 積，0.01 mL；V 樣總：加入提取液體(ti) 積，0.202mL；T：反應時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500 萬(wan) 。

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