Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒（可溶性蛋白）說明書(shu)

6×His-Tagged Protein Purification Kit 

目錄號：  K0894       

保    存：  蛋白酶抑製劑混合物，-20℃；  其它組分，2-8℃。 

組分說明 

Cat.No.                 K0894         K0894A

KitSize                     2ml            5ml

Ni-Agarose 填料                2ml            5ml

細菌裂解液                   25ml           65ml

1MTris（pH7.9）               6ml           15ml

1M  咪唑                    25ml          65ml

3M 氯化鈉                    50ml         2×60ml

蛋白酶抑製劑混合物             0.3ml          0.7ml

親(qin) 和柱空柱                  1個(ge) (6ml)      1 個(ge)  (12ml)

產(chan) 品簡介

      本試劑盒包含Ni-Agarose 填料、親(qin) 和柱空柱以及可溶性His 融合蛋白純化所需的全部試劑（細菌裂解液、蛋白酶抑製劑混合物、結合緩衝(chong) 液和洗脫緩衝(chong) 液組分），使用方便。該鎳柱純化係統對6×His-tag 蛋白具有顯著特異吸附能力，能夠高效一步純化帶有 6 個(ge) 組氨酸親(qin) 和標簽的蛋白。該係統具有4 個(ge) Ni2+ 螯合位點，較隻有3 個(ge) 螯合位點的Ni-IDA 結合 Ni2+ 更為(wei) 牢固，有效防止純化過程中 Ni2+ 脫落且增強對 His 標簽蛋白的結合能力，提高純化效率。較高的基團密度，大大提高了蛋白載量。該係統在天然或變性條件下，對來源於(yu) 各種表達係統（如杆狀病毒，哺乳細胞，酵母以及細菌）中的His 標簽蛋白，均有很好的純化效果。本產(chan) 品已螯合鎳離子，可直接用可溶性蛋白的純化，使用方便，快捷。

      支 持 物： CL-6B 瓊脂糖凝膠

      載量：20-30mgHis標簽蛋白/ml 填料

      粒徑：50-160 μm

注意事項 

 1. 在純化之前采用電泳檢測蛋白的可溶性，本試劑盒隻適合於(yu) 可溶性蛋白的純化，如需純化包涵體(ti) 蛋白，請選擇我公司的包涵體(ti) 蛋白純化試劑盒，貨號為(wei) K0893。

 2. 緩衝(chong) 液中不建議使用 β-巰基乙醇、DTT 和EDTA。

 3. 整個(ge) 純化過程中切忌凝膠脫水變幹。

 4. 為(wei) 提高純化效率，首先確定BindingBuffer 和  ElutionBuffer 中咪唑的*使用濃度。必要時可以使用線性或梯度濃度的咪唑濃度，BindingBuffer 的範圍為(wei) 0-10mM，洗脫緩衝(chong) 液的範圍為(wei) 10-500mM來進行。並通過SDS-PAGE或WesternBlotting 來檢測目的蛋白的純度。

 5. 請使用高純度的試劑配製緩衝(chong) 液，並通過0.22µm 或者0.45µm 過濾器過濾。為(wei) 避免柱子被堵塞，建議將裂解液進行離心，或者使用0.22µm 或者0.45µm 過濾器過濾。

  6. 柱再生時，保證每步洗完後都要用足夠的去離子水衝(chong) 洗至中性。

操作步驟 

組裝層析柱 

  1. 將填料混勻後加入層析柱，室溫靜置10 分鍾，待凝膠與(yu) 溶液分層後，把底部的出液口打開，讓乙醇通過重力作用緩慢流出。

      注意：（1）填料的上層是乙醇保護層，將填料和乙醇一起混勻，以每ml填料純化20-30mgHis標簽蛋白計算，取需要的填料與(yu) 乙醇的混合 液加入層析柱。

（2）如果乙醇不流出，可以給柱子一個(ge) 外力，例如用大拇指對柱口輕輕按壓一下，迫使乙醇流出。

（3）本實驗都是通過重力作用使溶液流出。

  2. 向裝填好的柱中加入5倍柱體(ti) 積的去離子水將乙醇衝(chong) 洗幹淨後，再用 10 倍柱體(ti) 積的Binding Buffer 平衡柱子，平衡結束後即可上樣。

注意：柱體(ti) 積指的是填料的體(ti) 積。

可溶性蛋白的純化（BindingBuffer和ElutionBuffer配方詳見附表1） 

  1.  收集菌體(ti) 後，每100mg菌體(ti) （濕重）加入1-5 ml細菌裂解液（每1ml 細菌抽提試劑中已加入10 μl 蛋白酶抑製劑混合物），超聲裂解菌體(ti) 。

注意：（1） 當提取物粘度高或提取蛋白為(wei) 包涵體(ti) 時，建議加入DNaseI和Lysozyme。每1ml 細菌抽提試劑中加入1μlDNaseI（1,000U/ml），2μlLysozyme（50mg/ml），DNaseI和Lysozyme可單獨從(cong) 我公司購買(mai) ，貨號：Lysozyme(#YJ0887)、 DNaseI(#YJ2090A)，如使用其它公司產(chan) 品，請按照相應說明書(shu) 操作。

（2）超聲過程中保持菌液處於(yu) 冰浴中，超聲條件依賴於(yu) 所使用的超聲儀(yi) 功率，探頭種類，容器的大小形狀，需實驗中自己摸索，應避免連續超聲導致的大量產(chan) 熱，可分成短時間，多次超聲，通過一定的間隔時間避免溶液過熱。終以菌液變清即可。

  2.  10000rpm,4℃離心3分鍾，收集上清中的可溶性蛋白。

  3.  用BindingBuffer將菌體(ti) 裂解液等倍稀釋後負載上柱，流速為(wei) 10倍柱體(ti) 積/小時，收集流穿液。

注意：（1）本試劑盒中附帶有一塊篩板，使用時先將篩板加至填料的上層，該篩板可用於(yu) 雜質較多的蛋白的過濾，防止過多的雜蛋白堵塞柱子的作用。再將處理好的樣品負載上柱，但是篩板放入柱子後就不易取出。

（2）通過控製加入的菌體(ti) 裂解液的速度來控製流速。

  4.  使用15倍柱體(ti) 積的Soluble Binding Buffer衝(chong) 洗柱子，洗去雜蛋白。

  5.  使用適量Soluble Elution Buffer洗脫，收集洗脫峰。

      注意：洗脫峰可以分管收集，每1ml收集1管，並采用蛋白監測儀(yi) 監測，收集洗脫峰。

  6.  洗脫後，依次使用10倍柱體(ti) 積的去離子水洗滌柱子，再用3倍柱體(ti) 積的20%乙醇平衡（乙醇要將填料浸沒），4℃保存。

      注意：如果是分段梯度洗脫，大洗脫緩衝(chong) 液中咪唑濃度未達到500mM時，則使用濃度為(wei) 500mM的咪唑進行洗脫10倍柱體(ti) 積後，再進行第6步的操作。

柱再生

      當填料使用多次後，結合效率會(hui) 有所下降（表現為(wei) 流速變慢或填料失去藍綠色），可以用以下方法再生，提高填料的使用壽命和蛋白質的結合效率。

  1. 使用2 倍柱體(ti) 積的6M鹽酸胍衝(chong) 洗後，使用3 倍柱體(ti) 積的去離子水衝(chong) 洗。

  2. 使用1 倍柱體(ti) 積2% SDS衝(chong) 洗。

  3. 依次使用1倍柱體(ti) 積的25%、50%、75%和5 倍柱體(ti) 積100%乙醇衝(chong) 洗，再依次使用 1 倍柱體(ti) 積的75%、50%、25%的乙醇衝(chong) 洗。             

 4. 使用1 倍柱體(ti) 積的去離子水衝(chong) 洗。

 5. 使用5 倍柱體(ti) 積含50 mM EDTA 緩衝(chong) 液（PH8.0）衝(chong) 洗。

 6. 使用3 倍柱體(ti) 積去離子水，3 倍柱體(ti) 積20%乙醇衝(chong) 洗。

 7. 4°C 保存。

 8. 再次使用前，需首先使用10 倍柱體(ti) 積去離子水衝(chong) 洗，然後使用5個(ge) 柱體(ti) 積50 mM NiSO4再生，3 個(ge) 柱體(ti) 積的Binding Buffer平衡。

                                         附表  1. 可溶性蛋白純化緩衝(chong) 液配方

                                                         

成分                   Tris-HCl（PH7.9）   咪唑       NaCl

SolubleBindingBuffer       20mM          10mM       0.5M

SolubleElutionBuffer       20mM        500mM         0.5M



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