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細胞周期與凋亡檢測試劑盒說明書
點擊次數:3447 更新時間:2020-09-27

                                    

細胞周期與(yu) 凋亡檢測試劑盒說明書(shu)

 

Cell Cycle and Apoptosis Detection Kit 

 

目錄號:K2575   

保存:  -20℃避光保存 

 

組分說明

 

Cat.No.                 K2575

KitSize                    50

DyeingBuffer              22.5ml

25×PropidiumIodide,PI     750 μl 

 

產(chan) 品簡介 

 

    細胞周期與(yu) 凋亡檢測試劑盒是一種采用經典的碘化丙啶染色(Propidiumstaining,即  PIstaining)方法進行細胞周期與(yu) 細胞凋亡分析的檢測試劑盒。

碘化丙啶(Propidium,簡稱PI)是一種雙鏈DNA 的熒光染料。碘化丙啶和雙鏈 DNA 結合後可以產(chan) 生熒光,並且熒光強度和雙鏈DNA 的含量成正比。細胞內(nei) 的DNA被碘化丙啶染色後,可以用流式細胞儀(yi) 對細胞進行 DNA 含量測定,然後根據DNA 含量的分布情況,可以進行細胞周期和細胞凋亡分析。碘化丙啶染色後,假設G0/G1 期細胞的熒光強度為(wei) 1,那麽(me) 含有雙份基因組DNA 的G2/M期細胞的熒光強度的理論值為(wei) 2,正在進行DNA 複製的S期細胞的熒光強度為(wei) 1-2 之間。凋亡細胞由於(yu) 細胞核發生濃縮以及發生DNA*片段化(DNAfragmentation)導致部分基因組 DNA*片斷在染色過程中丟(diu) 失,因此凋亡細胞碘化丙啶染色後呈現明顯的弱染,即熒光強度小於(yu) 1,在流式檢測的熒光圖上出現所謂的sub-G1 峰,即凋亡細胞峰。細胞發生凋亡時,由於(yu) 胞漿和染色質濃縮、核碎裂,產(chan) 生凋亡小體(ti) ,使細胞的光散射性質發生變化。在細胞凋亡的早期,細胞對前向角光散射的能力顯著降低,對側(ce) 向光散射的能力增加或沒有變化。在細胞凋亡的晚期,前向和側(ce) 向光散射的信號均降低。因此可通過流式細胞儀(yi) 測定細胞光散射的變化觀察細胞凋亡情況。

    本試劑盒通常應用於(yu) 培養(yang) 的貼壁或懸浮細胞的細胞周期與(yu) 細胞凋亡檢測。如果用於(yu) 組織的細胞周期與(yu) 細胞凋亡檢測,則必須把組織消化成單細胞狀態,才可以進行檢測。

    本試劑盒每個(ge) 樣品的細胞數量可以為(wei) 10-100 萬(wan) 。

 注意事項 

 1.  本試劑盒需使用流式細胞儀(yi) 進行檢測。

2.  需自備PBS、95%乙醇和RNaseA。

3.  熒光染料均存在淬滅問題,保存和使用過程中請盡量注意避光,以減緩熒光淬滅。

4.  PI 對人體(ti) 有刺激性,請注意適當防護。

5.  請穿實驗服並戴一次性手套操作。

                                                                                                                                               操作步驟

 1. 細胞樣品的準備:

    a. 對於(yu) 貼壁細胞:小心收集細胞培養(yang) 液到一離心管內(nei) 備用。用胰酶消化細胞,至細胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來時,加入前麵收集的細胞培養(yang) 液,吹打下所有的貼壁細胞,並輕輕吹散細胞。再次收集到離心管內(nei) 。1000×g 左右離心3-5 分鍾,沉澱細胞。對於(yu) 特定的細胞,如果細胞沉澱不充分,可以適當延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清,可以殘留約50μl 左右的培養(yang) 液,以避免吸走細胞。加入約1毫升冰浴預冷的PBS,重懸細胞,再次離心沉澱細胞,小心吸除上清。再次加入1ml 冰浴預冷的PBS,重懸細胞。

    b. 對於(yu) 懸浮細胞:1000×g 左右離心3-5 分鍾,沉澱細胞。對於(yu) 特定的細胞,如果細胞沉澱不充分,可以適當延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清,可以殘留約 50 微升左右的培養(yang) 液,以避免吸走細胞。加入約1ml 冰浴預冷的PBS,重懸細胞,並轉移到1.5 毫升離心管內(nei) 。再次離心沉澱細胞,小心吸除上清,可以殘留約50μl左右的PBS,以避免吸走細胞。再次加入1ml 冰浴預冷的PBS,重懸細胞。

2. 細胞固定:

    取4 毫升冰浴預冷的95%乙醇,低速渦旋震蕩的同時加入 1 毫升細胞懸液,混勻後 4℃固定 2 小時或更長時間。固定12-24 小時可能效果更佳。1000×g 左右離心 3-5 分鍾,沉澱細胞。對於(yu) 特定的細胞,如果細胞沉澱不充分,可以適當延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清,可以殘留約50μl 左右的乙醇,以避免吸走細胞。加入約5ml 冰浴預冷的PBS,重懸細胞,再次離心沉澱細胞,小心吸除上清,可以殘留約50μl左右的PBS,以避免吸走細胞。輕輕彈擊離心管底以適當分散細胞,避免細胞成團。

3.PI 染色液的配製:

    參考下表,根據待檢測樣品的數量配製適量的PI 染色液:

         

                           1 個(ge) 樣品      6 個(ge) 樣品      12 個(ge) 樣品 

DyeingBuffer                 0.4ml    2.4ml    4.8ml 

25×PropidiumIodide,PI       15μl     90μl     180μl 

RNaseA(10mg/ml,自備)       1μl       6μl      12μl 

 

  注:配製好的PI 染色液短時間內(nei) 可以4℃保存,宜當日使用。

4. 染色:

    每管細胞樣品中加入400μlPI 染色液,緩慢並充分重懸細胞沉澱,37℃避光溫浴 30 分鍾。隨後可以4℃或冰浴避光存放。染色完成後宜在24 小時內(nei) 完成流式檢測,*h能在當日完成流式檢測。

5. 流式檢測和分析:

    用流式細胞儀(yi) 在激發波長488nm 波長處檢測紅色熒光,同時檢測光散射情況。采用適當分析軟件進行細胞DNA 含量分析和光散射分析。

 

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