哺乳動物蛋白抽提試劑盒說明書(shu)

Mammalian Protein Extraction Kit

貨號： K0889   

保存：蛋白酶抑製劑混合物：-20℃

其 它 組 分 ：   室   溫   

 組分說明

Catalog no.                                 K0889      K0889A

Kit Size                                    25  次      100  次

Mammalian Protein Extraction Reagent          25 ml        100 ml

蛋白酶抑製劑混合物                            250 μl       1 ml

產(chan) 品簡介

      哺乳動物蛋白抽提試劑能夠快速，溫和，高效的裂解哺乳動物細胞，有效提取細胞漿和細胞核蛋白。該試劑使用溫和配方保證所提取蛋白保持生物學活性並可應用於(yu) 多種蛋白分析試驗，如：報告基因和酶活性測定，免疫檢測，蛋白純化等。提取後蛋白可采用  BCA  法進行蛋白定量分析。哺乳動物蛋白抽提試劑盒中帶有蛋白酶抑製劑混合物，可有效避免蛋白提取過程中蛋白的降解。

注意事項

 1. 本產(chan) 品可有效裂解細胞培養(yang) 板培養(yang) 的貼壁細胞（無需刮取）以及離心收集的懸浮細胞，較反複凍融或超聲法具有更高提取效率。但對於(yu) 組織蛋白的抽提，建議使用組織蛋白抽提試劑（#K0004，#K0891）。

 2. 表一中所列的是貼壁細胞蛋白提取的z佳使用量，如果需要減少試劑用量從(cong) 而獲得更高的蛋白濃度，建議首先刮取細胞。

 3. 對於(yu) 離心獲得的細胞，如果丌知道細胞的體(ti) 積，可以根據細胞數量估計抽提試劑的使用量。如2×10⁶個(ge) Hela 細胞約重20 mg，需要加入200μl 抽提試劑，以此類推。

 4. 通過本產(chan) 品提取的蛋白，可通過BCA法進行蛋白定量分析。

操作步驟        

 ●  貼壁細胞蛋白抽提

 1.  小心傾(qing) 去貼壁細胞的培養(yang) 液。

 2.  注意：如培養(yang) 基中含有酚紅或其他可能影響試驗結果的物質，請先使用PBS漂洗細胞。

 3.  請在蛋白抽提前取出實驗所需蛋白抽提試劑進行預冷，                            按照1:99比例加入蛋白酶抑製劑混合物（例如990μl抽提試劑中加入10μl蛋白酶抑製劑混合物），使蛋白酶抑製劑混合物在抽提試劑中成1×工作液。

     注意：在進行蛋白抽提前2-3分鍾內(nei) 加入蛋白酶抑製劑混合物。

 4.  加入適量哺乳動物蛋白抽提試劑，（在冰上用槍頭吹打貼壁細胞，將裂解液轉移至離心管中），冰上孵育20分鍾，讓細胞充分裂解（試劑使用量請參考附表1，冰上放置時間應根據細胞類型丌同進行調整）                                          。

 5.  14,000×g離心5-10分鍾。

 6.  轉移上清液至新管中，用於(yu) 進一步分析。

 ●  懸浮細胞蛋白提取

 1. 將懸浮細胞2,500×g，離心10分鍾，棄去上清。

 2. 可選步驟：漂洗。如培養(yang) 基中含有酚紅或其他可能影響實驗結果的物質，請使用PBS漂洗細胞。

 3. 漂洗後的細胞懸浮液2,500×g，離心10min，棄去上清。

 4. 請在蛋白抽提前取出實驗所需蛋白抽提試劑進行預冷按照1:99比例加入蛋白酶抑製劑混合物（例如990μl抽提試劑中加入10μl蛋白酶抑製劑混合物），使蛋白酶抑製劑混合物在抽提試劑中成1×工作液。

     注意：在進行蛋白抽提前2-3分鍾內(nei) 加入蛋白酶抑製劑混合物。

 5. 加入適量哺乳動物蛋白抽提試劑，每100 mg (~100 µl)細胞至少加入1 ml哺乳動物蛋白抽提試劑。如提取的樣本量較大，可首先使用抽提試劑總使用量的1/10重懸細胞沉澱，然後加入剩餘(yu) 抽提試劑。

 6. 吹打均勻後，冰上放置20分鍾，讓細胞充分裂解（冰上放置時間應根據細胞類型丌同進行調整）。                                                 

 7. 14,000×g離心15分鍾。

 8. 轉移上清至新管中，進行下一步分析。

     注：每100 mg細胞約可提取到6 mg的總蛋白（細胞類型丌同略有差異）。                      

參考附表

                                            表  1. 抽提試劑使用量推薦表

細胞培養(yang) 板類型或平皿類型        抽提試劑使用量

100 mm                         500-1,000 µl

60 mm                           250-500 µl

6 孔培養(yang) 板                         200-400 µl /孔

24 孔培養(yang) 板                         100-200 µl /孔

96 孔培養(yang) 板                          50-100 µl/孔

* 對於(yu)  100 mm  培養(yang) 板培養(yang) 的10⁷個(ge) 細胞  (50 mg)可裂解獲得約3 mg 總蛋白（細胞類型不同略有差異）。            

 2. 常見問題及解決(jue) 辦法

 1. 低提取率

可能原因：

a低蛋白表達量

b試劑使用量不夠

c試劑無法溶解細胞膜

解決(jue) 方法：

a優(you) 化轉染係統

b增加抽提試劑使用量

c增加裂解時間或者加大晃動幅度

2. 無法獲得膜蛋白  

可能原因：用哺乳動物蛋白抽提試劑提取核/漿蛋白  

解決(jue) 方法：使用真核細胞膜蛋白抽提試劑盒                                                                                                               

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