三聚氰胺

快速檢測試劑盒說明書(shu)

一、原理

本試劑盒采用間接競爭(zheng) ELISA方法，在微孔條上預包被偶聯抗原，樣本中的殘留物三聚氰胺將和微孔條上預包被的偶聯抗原競爭(zheng) 抗三聚氰胺抗體(ti) ，加入酶標記物後，用TMB底物顯色，樣本吸光值與(yu) 其所含殘留物三聚氰胺的含量成負相關(guan) ，與(yu) 標準曲線比較即可得出相應殘留物三聚氰胺的含量。

二、試劑盒特性

• 試劑盒靈敏度：   0.5ppb
• 孵育溫度：       25℃
• 孵育時間：       30min～15min
• 樣本檢測下限

生鮮乳、液態奶 ···································  5 ppb

酸奶、奶粉 ········································  10ppb

• 交叉反應率

三聚氰胺  ·········································  100%

• 樣本回收率

生鮮乳、液態奶 ···························   90% ±25%

酸奶、奶粉 ·································   80% ±25%

三、試劑盒組成

四、所用儀(yi) 器、試劑

具備的儀(yi) 器：酶標儀(yi) 、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）

微量移液器：單道 20µl～200µl、單道100µl～1000µl、多道 30～300 µl

五、樣本前處理步驟

• 樣本處理前須知

（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。

（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否幹淨，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免汙染幹擾實驗結果。

• 需配置的試劑

試劑1：樣本提取液

   將20X樣本提取液與(yu) 去離子水1:19稀釋備

   用。

試劑2：樣品稀釋液

   將5X樣品稀釋液與(yu) 去離子水1:4稀釋備用。

• 樣本處理：

（a）牛奶（純牛奶、生鮮乳等液體(ti) 奶）樣本處理

• 取新鮮的牛奶樣本50µl用於分析。

樣本稀釋倍數:  1倍 

備注：較為(wei) 粘稠的酸奶、煉乳製品無法使用此方法檢測。

（b）奶粉樣本處理

• 取1g新鮮奶粉樣本於50ml離心管中；加入10ml樣本提取液，渦旋振蕩3min，4000r/min以上，室溫離心10min；
• 取上層50µl液體用於分析。

樣本稀釋倍數:  10倍 

（c）酸奶樣本處理

• 取1g新鮮酸奶樣本於10ml/15ml/50ml離心管中；加入5ml樣品稀釋液，渦旋振蕩1min，靜置10min；
• 取上層50µl液體用於分析。

    樣本稀釋倍數:  5倍 

六、 酶標免疫分析程序:

• 測定前應須知：

• 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20～25℃）。
• 使用之後立即將所有試劑放回2～8℃。
• 在ELISA分析中的再現性，很大程度上取決於洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。
• 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。

• 操作步驟：

• 從2～8℃冷藏環境中取出所需試劑，室溫（20～25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
• 取出框架及需要數量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存於2-8℃。
• 配液：將15ml 20X濃縮洗滌液用去離子水稀釋至800ml。
• 編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，並記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
• 加標準品/樣品50µl/孔到各自的微孔中，加入酶標記物50µl/孔，然後再加入抗體工作液50µl/孔，用蓋板膜封板，25℃環境中反應30min。
• 將孔內液體甩幹，用已稀釋的洗滌液250µl/孔洗板5～6次，每次間隔15～30秒，用吸水紙拍幹（拍幹後未清除的氣泡可用幹淨的槍頭刺破）。
• 顯色：加入底物A液50µl/孔，再加入底物B液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環境中避光顯色15min。
• 測定：加入終止液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀於450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，5min內讀數），測定每孔OD值。

七、結果判定

結果判定有兩(liang) 種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與(yu) 其所含三聚氰胺量成負相關(guan) 。

1、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與(yu) 標準值比較即可得出其濃度範圍(ng/ml)。假設樣本1的吸光度值為(wei) 0.3，樣本2的吸光度值為(wei) 1.0，標準液吸光度值分別是：0ppb為(wei) 2.043； 0.5ppb為(wei) 1.554；1.5ppb為(wei) 1.015；4.5ppb為(wei) 0.474；13.5ppb為(wei) 0.151；40.5ppb為(wei) 0.055。則樣本1的濃度範圍是4.5ppb～13.5ppb；樣本2的濃度範圍是1.5ppb～4.5ppb，乘以其對應的稀釋倍數即為(wei) 樣本中三聚氰胺實際濃度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等於(yu) 標準品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第--個(ge) 標準（0標準）的吸光度值，再乘以100%，即

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值

（2）標準曲線的繪製與(yu) 計算

以標準品百分吸光率為(wei) 縱坐標，以三聚氰胺標準品濃度（ng/ml）的半對數為(wei) 橫坐標，繪製標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從(cong) 標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為(wei) 樣本中三聚氰胺實際濃度。

若利用試劑盒專(zhuan) 業(ye) 分析軟件進行計算，更便於(yu) 大量樣本的準確、快速分析。

八、 注意事項

• 室溫低於25℃或試劑及標本未回到室溫（20～25℃）會導致所有標準的OD值偏低。
• 在洗板過程中如果出現板孔幹燥的情況，則會伴隨著標準曲線不成線性，重複性不好的現象。所以洗板拍幹後應立即進行下一步操作。
• 混合要均勻，否則會出現重複性不好的現象。
• 反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
• 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。
• 不用的微孔板放進自封袋重新密封；標準物質和無色的發色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
• 顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。標準品1的吸光度值小於0.5時，表示試劑可能變質。
• 該試劑盒Z佳反應溫度為25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。

九、儲(chu) 藏條件和保質期

• 儲藏條件：試劑盒於2～8℃保存，不要冷凍。
• 保 質 期：該產品有效期為1年，生產日期見包裝盒。

提示：酶標板真空包裝袋若有漏氣，酶標板仍然正常有效，不影響實驗結果，請放心使用。