四環素乳品快速檢測試劑盒說明書(shu)

一、原理

本試劑盒采用間接競爭(zheng) ELISA方法，在微孔條上預包被偶聯抗原，樣本中的殘留物四環素將和微孔條上預包被的偶聯抗原競爭(zheng) 抗四環素抗體(ti) ，加入酶標記物後，用TMB底物顯色，樣本吸光值與(yu) 其所含殘留物四環素的含量成負相關(guan) ，與(yu) 標準曲線比較即可得出相應殘留物四環素的含量。

二、試劑盒特性

試劑盒靈敏度：  0.05ppb

孵育溫度：      25℃

孵育時間：      30min～15min

樣本檢測下限

雞肉樣本：

四環素 ···········································  0.4ppb

二甲an四環素 ··································  0.4ppb

吡四環素 ········································  0.4ppb

金黴素   ········································  0.4ppb

脫甲基金黴素 ·································  1.2ppb

土黴素 ··········································  0.8ppb

強力黴素 ·······································   1ppb

蜂蜜樣本：

四環素 ··········································  0.5ppb

二甲an四環素 ·································  0.5ppb

吡四環素 ······································   0.5ppb

金黴素 ·········································   0.5ppb

脫甲基金黴素 ································   1.5ppb

土黴素 ···········································   1ppb

強力黴素 ········································  1.2ppb

交叉反應率

四環素 ··········································  100%

二甲an四環素 ·································  125%

吡四環素  ·······································   110%

金黴素  ···········································  100%

脫甲基金黴素 ···································   35%

土黴素  ············································  58%

強力黴素  ·········································  45%

樣本回收率

蜂蜜 ···········································  85±20%

三、試劑盒組成

四、所用儀(yi) 器、試劑

具備的儀(yi) 器：酶標儀(yi) 、均質器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）、恒溫箱

微量移液器：單道 20～200µl、單道100～1000µl、多道 30～300 µl

試      劑：甲醇

五、樣本前處理步驟

樣本處理前須知

（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。

（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否幹淨，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免汙染幹擾實驗結果。

樣本前處理需配製：

配液1  樣本提取液A

用去離子水450ml與(yu) 50ml 10X樣本提取液混勻或按9：1的比例按需配製（如10X樣本提取液有結晶，需溶解後在進行稀釋）。                                      

配液2  樣本提取液B

取甲醇50ml與(yu) 310ml樣本提取液A混勻或按5:31的比例按需配製。

樣本處理                  

蜂蜜處理方法

1、 稱取1±0.05g均質後的樣本於(yu) 50ml離心管中，加入10ml樣本提取液B（見配液2），振蕩3min，室溫4000r/min以上，離心5min； 取50 µl上清液用於(yu) 分析

樣本稀釋倍數: 10倍                        

六、 酶標免疫分析程序:

測定前應須知：

使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20～25℃）。

使用之後立即將所有試劑放回2～8℃。

在ELISA分析中的再現性，很大程度上取決(jue) 於(yu) 洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。

所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。

操作步驟：

從(cong) 2～8℃冷藏環境中取出所需試劑，室溫（20～25℃）平衡30min以上，注意每種液體(ti) 試劑使用前均須搖勻。

配製標準品

標準品6：50µl標準品濃縮液（81ppb）用950µl標準品複溶液稀釋    4.05ppb

標準品5：600µl標準品複溶液與(yu) 300µl標準品6混合                1.35ppb

標準品4：600µl標準品複溶液與(yu) 300µl標準品5混合                0.45ppb

標準品3：600µl標準品複溶液與(yu) 300µl標準品4混合                0.15ppb

標準品2：600µl標準品複溶液與(yu) 300µl標準品3混合                0.05ppb

標準品1：標準品複溶液         0ppb                                         

取出框架及需要數量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存於(yu) 2-8℃。

配液：將15ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配製洗滌液。

編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個(ge) 樣本和標準品做2孔平行，並記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

加標準品/樣本50µl/孔到各自的微孔中，然後加加入酶標記物50µl/孔再加入抗體(ti) 工作液50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻。25℃環境中反應30min。

將孔內(nei) 液體(ti) 甩幹，用已稀釋的洗滌液250µl/孔洗板4～5次，每次間隔15～30秒，用吸水紙拍幹（拍幹後未清除的氣泡可用幹淨的槍頭刺破）。

顯色：加入底物A液50µl/孔，再加入底物B液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環境中避光顯色15min。

測定：加入終止液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀(yi) 於(yu) 450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，5min內(nei) 讀數），測定每孔OD值。

七、結果判定

結果判定有兩(liang) 種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與(yu) 其所含四環素量成負相關(guan) 。

1、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與(yu) 標準值比較即可得出其濃度範圍(ng/ml)。假設樣本1的吸光度值為(wei) 0.3，樣本2的吸光度值為(wei) 1.0，標準液吸光度值分別是：0ppb為(wei) 2.243； 0.05ppb為(wei) 1.816；0.15ppb為(wei) 1.415；0.45ppb為(wei) 0.74；1.35ppb為(wei) 0.313；4.05ppb為(wei) 0.155。則樣本1的濃度範圍是1.35ppb～4.05ppb；樣本2的濃度範圍是0.15ppb～0.45ppb，乘以其對應的稀釋倍數即為(wei) 樣本中四環素實際濃度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等於(yu) 標準品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以第--個(ge) 標準（0標準）的吸光度值，再乘以100%，即

百分吸光率（%）＝

B

×100%

B0

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值

（2）標準曲線的繪製與(yu) 計算

以標準品百分吸光率為(wei) 縱坐標，以四環素標準品濃度（ng/ml）的半對數為(wei) 橫坐標，繪製標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從(cong) 標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為(wei) 樣本中四環素實際濃度。

若利用試劑盒專(zhuan) 業(ye) 分析軟件進行計算，更便於(yu) 大量樣本的準確、快速分析。

八、 注意事項

室溫低於(yu) 25℃或試劑及標本未回到室溫（20～25℃）會(hui) 導致所有標準的OD值偏低。

在洗板過程中如果出現板孔幹燥的情況，則會(hui) 伴隨著標準曲線不成線性，重複性不好的現象。所以洗板拍幹後應立即進行下一步操作。

混合要均勻，否則會(hui) 出現重複性不好的現象。

反應終止液為(wei) 2M硫酸，避免接觸皮膚。

不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會(hui) 引起靈敏度、OD值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。

不用的微孔板放進自封袋重新密封；標準物質和無色的發色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。標準品1的吸光度值小於(yu) 0.5時，表示試劑可能變質。

該試劑盒Jia反應溫度為(wei) 25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。

九、儲(chu) 藏條件和保質期

儲(chu) 藏條件：試劑盒於(yu) 2-8℃保存，不要冷凍。

保 質 期：該產(chan) 品有效期為(wei) 1年，生產(chan) 日期見包裝盒。

提示：酶標板真空包裝袋若有漏氣，酶標板仍然正常有效，不影響實驗結果，請放心使用。

三、試劑盒組成