Annexin V-Alexa Fluor 647/PI 凋亡檢測試劑盒說明書(shu)

Annexin V-Alexa Fluor 647/PI Apoptosis Detection Kit 

貨號：K2577     

保存：2-8  ℃避光保存 

組分說明

Cat.No.                    K2577

KitSize                     50

4×BindingBuffer            10ml

PropidiumIodide,PI          500 μl

AnnexinV-AlexaFluor647    250 μl

產(chan) 品簡介 

   AnnexinV-AlexaFluor647/PI凋亡檢測試劑盒是一種采用AnnexinV-AlexaFluor647與(yu) PI 雙染法進行細胞早期凋亡分析的檢測試劑盒。

   細胞凋亡早期改變發生在細胞膜表麵，這些細胞膜表麵的改變之一是磷脂酰絲(si) 氨酸（PS）從(cong) 細胞膜內(nei) 轉移到細胞膜外，使PS 暴露在細胞膜外表麵。PS 是一種帶負電荷的磷脂，正常主要存在於(yu) 細胞膜的內(nei) 麵，在細胞發生凋亡時細胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使PS暴露在細胞膜外。Annexin V具有易於(yu) 結合到磷脂類如 PS 的特性，對PS 有高度的親(qin) 和性。因此，該蛋白可充當一敏感的探針檢測暴露在細胞膜表麵的PS。PS 轉移到細胞膜外不是凋亡所*的，也可發生在細胞壞死中。兩(liang) 種細胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細胞膜是完好的，而細胞壞死在其早期階段細胞膜的完整性就被破壞。另外一種活細胞非透過性熒光染料碘化丙啶（PropidiumIodide,PI）不能通過完整的活細胞，但能夠對壞死和凋亡晚期的細胞進行染色，因此通常將 AnnexinV 與(yu) PI 配合染色，以區別凋亡早期細胞與(yu) 壞死細胞和凋亡的晚期細胞。

注意事項 

1.  消化細胞時不能用含EDTA 的胰酶。 

2.  本試劑盒需使用流式細胞儀(yi) 進行檢測。

3.  需自備PBS 和去離子水。

4.  熒光染料均存在淬滅問題，保存和使用過程中請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

5.  PI 對人體(ti) 有刺激性，請注意適當防護。

6.  請穿實驗服並戴一次性手套操作。

操作步驟 

1. 細胞樣品的準備：

    a. 對於(yu) 貼壁細胞：小心收集細胞培養(yang) 液到一離心管內(nei) 備用。用胰酶消化細胞，至細胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來時，加入前麵收集的細胞培養(yang) 液，吹打下所有的貼壁細胞，並輕輕吹散細胞。再次收集到離心管內(nei) 。1000×g 左右離心3-5 分鍾，沉澱細胞。對於(yu) 特定的細胞，如果細胞沉澱不充分，可以適當延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約50 μl 左右的培養(yang) 液，以避免吸走細胞。加入約1 ml 4℃預冷的    PBS，重懸細胞，再次離心沉澱細胞，小心吸除上清。再次加入1ml4℃預冷的 PBS，重懸細胞，再次離心沉澱細胞。

    b. 對於(yu) 懸浮細胞：1000×g 左右離心3-5 分鍾，沉澱細胞。對於(yu) 特定的細胞，如果細胞沉澱不充分，可以適當延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約                            50 微升左右的培養(yang) 液，以避免吸走細胞。加入約 1 ml 4℃預冷的PBS，重懸細胞，並轉移到1.5 毫升離心管內(nei) 。再次離心沉澱細胞，小心吸除上清，可以殘留約                                50μl 左右的   PBS，以避免吸走細胞。再次加入1ml4℃預冷的PBS，重懸細胞，再次離心沉澱細胞。

2.  用去離子水按1:4 稀釋  BindingBuffer（4mlBindingBuffer+12ml 去離子水）；

3.  用 250μlBindingBuffer 重新懸浮細胞，調節其濃度為(wei) 1×106/ml；

4.  取100μl 的細胞懸液於(yu) 5ml 流式管中，加入5μlAnnexinV/AlexaFluor647 和  10μl20μg/ml 的 PI 溶液；

5.  混勻後於(yu) 室溫避光孵育15 分鍾；

6.  在反應管中加400μlPBS，流式細胞儀(yi) （FACS）分析。

    

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