一步法快速WB（HRP）試劑盒（鼠）說明書(shu)

One Step Western Kit HRP（Mouse）

目錄號：  K2030     

保   存：  2 - 8  ℃，避免冷凍

組分說明

Cat. No.                  K2030        K2030A      K2030B

Kit Size                    10           2            50

封閉液                   125 ml        30 ml        500 ml

抗體(ti) 反應液 HRP（鼠）    1 ml          200  μl      5×1 ml

抗體(ti) 稀釋液               125 ml        30 ml        500 ml

漂洗液（10×）           125 ml        30 ml        500 ml

產(chan) 品簡介

      一步法快速WB 試劑盒（鼠）是上海研謹生物新的Western  Blot 檢測試劑盒，能夠在1 小時左右得到高質量的 Western Blot 結果，且操作簡便、檢測靈敏度高、背景低、不需再加入二抗、係統穩定性強。常規的Western Blot 間接 法檢測過程（封閉、一抗結合和二抗結合）需要較長的時間，實驗流程複雜且需要多步條件優(you) 化。膠上的蛋白轉移到載體(ti) 膜上後，使用試劑盒中的封閉液孵育5 min，再用抗體(ti) 反應液處理後的一抗孵育載體(ti) 膜，經洗滌三次（每次5 分鍾）後，即可進行發光或顯色檢測。本試劑盒針對目的蛋白一抗為(wei) 鼠來源的實驗係統使用。

注意事項

 1.  客戶自己準備鼠來源的一抗。

 2.  使用封閉液、抗體(ti) 稀釋液（鼠）、漂洗液之前請充分混勻。

 3.  漂洗液如在2-8  ℃保存時出現沉澱，請恢複到室溫，把沉澱溶解後正常使用，1×漂洗液可在室溫保存一個(ge) 月。

 4.  建議轉膜完成後用麗(li) 春紅等試劑染色，並把膜上多餘(yu) 部分剪去以增加試劑的使用效率。

 5.  一抗和抗體(ti) 反應液HRP（鼠）需要通過預實驗來確定最佳的稀釋用量。

 6.  抗體(ti) 反應液HRP（鼠）、抗體(ti) 稀釋液和抗體(ti) 用量可根據膜的大小按比例放大或減少。

 7.  加入一抗的抗體(ti) 稀釋液可以回收重複使用一次。特異性及親(qin) 和力不好的抗體(ti) 建議不重複回收使用。回收後抗體(ti) 如在1-2天內(nei) 使用放置在2-8  ℃，長期保存請在-20℃凍存，避免多次反複凍融。

 8.  如果存在較高背景的情況，請調整抗體(ti) 的用量，並增加洗膜次數。

 9.  試劑盒內(nei) 所有試劑請於(yu) 2-8  ℃保存，避免凍融。

 操作步驟

 本產(chan) 品適用於(yu) 轉膜完成後的封閉及抗體(ti) 孵育步驟，以5 cm×8 cm 膜為(wei) 例：

 1.  漂洗液準備：取10 ml 10×漂洗液用蒸餾水稀釋至100 ml，待用。每次洗膜用8-10 ml。

 2.  轉膜完成後，將膜浸沒到10 ml封閉液中，室溫封閉5分鍾。

 3.  倒掉封閉液，加入8-10 ml 1×漂洗液，於(yu) 搖床上用較大速度漂洗1分鍾。

  4.  洗膜的同時可準備抗體(ti) 孵育液：取抗體(ti) 反應液HRP（鼠）100μl到EP管中，加入鼠源一抗3-10μg，槍頭吸打至充分混勻，室溫孵育5分鍾。

  5.  將混勻的抗體(ti) 與(yu) 反應液HRP（鼠）混合液加入到10 ml  抗體(ti) 稀釋液中，充分混勻。

 注意：1）一抗的用量也可根據抗體(ti) 的稀釋度來進行調整。以抗體(ti) 的最終稀釋度1:1000為(wei) 例，取100μl抗體(ti) 反應液HRP（鼠）到EP管中，加入10μl一抗，加入到10 ml  抗體(ti) 稀釋液中，充分混勻，室溫孵育5分鍾。

2）如果膜麵積較小，可按比例減少抗體(ti) 、反應液及稀釋液的用量。

6.  步驟3中，洗膜完成後，倒掉漂洗液，將一抗、反應液及稀釋液混合而成的抗體(ti) 孵育液加到膜上（確保孵育液*浸沒膜表麵），在搖床上以適當速度室溫孵育40分鍾。

7.  棄去（回收）抗體(ti) 稀釋液，用1×漂洗液漂洗3-5次，每次3分鍾。

8.  進行後續檢測。建議采用ECL或者沉澱型TMB法進行檢測。

應用實例

A:  普通WB對照：beta-actin鼠單抗（K0096）5ug室溫孵育40min，洗膜後二抗羊抗鼠-HRP

 （K0102）1：10000稀釋，室溫40min，ECL（K0049）曝光

 B:  一步法WB： beta-actin鼠單抗（K0096）5ug 室溫孵育40min ，ECL（K0049）曝光

 實例一  抗原為(wei)         293T 細胞全裂解液（K0065） 

 C：普通 WB 對照：GST 鼠單抗（K0084）2.5ug 室溫孵育40min，洗膜後二抗羊抗鼠-HRP

 （K0102）1：10000 稀釋，室溫40min，ECL（K0049）曝光。

 D：一步法WB：  GST 鼠單抗（K0084）2.5ug  室溫孵育40min ，ECL（K0049）曝光。

 實例二  抗原為(wei)         E.coli 多標簽蛋白裂解液（K2016） 

 常見問題及解決(jue) 辦法  

 問題：信號太弱或者看不到條帶                                                      

可能原因：

a蛋白上樣量太少

b蛋白轉膜效率太低

c一抗親(qin) 和力較低

解決(jue) 方案：  

A 進行SDS-PAGE電泳時加大上樣量。

B 優(you) 化轉膜時間或者電流，確保轉膜時膜與(yu) 膠之間沒有氣泡。  

C 增加膜在溶液（含有mixture 1的WB-2）中的孵育時間。 增加抗體(ti) 濃度可以增加信號。

D 對於(yu) 低親(qin) 和力抗體(ti) 來說，減少洗膜時間可以增加信號。由每次10min，減少到每次5min     可以增加信號。  

問題：背景偏高

可能原因：

a 一抗使用過量                      

b一抗有非特異性結合或者與(yu) 封閉試劑有交叉反應     

c洗膜時間太短

d曝光顯影時間過長

e容器或者試劑被汙染

解決(jue) 方案：

A  減少一抗的使用量，相應的減少WB-1用量。

B  使用 pretreat A-b（M01052）。客戶還可以使用 Quick Block Optimization kit 來找到最jia的封閉試劑。

C  增加洗滌的步驟可以進一步的降低背景。

D  減少曝光時間。如果信號和背景都高，可以等待一段時間，等背景信號減弱後，再進行  曝光。

E  每次洗滌的時候使用清潔的容器。帶手套，使用清潔的鑷子處理膜。

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