血液RNA提取試劑盒說明書(shu)

RNApure Blood Kit

 Cat. No.   K0582

保存：室  溫

組分說明

                                           Cat. No.                 K0582

                                            Kit Size                  50

                                      Buffer RBL（10×）             60 ml

                                           Buffer RL                  35 ml

                                         Buffer RW1                  40 ml

                                 Buffer RW2（concentrate）             11 ml

                                      RNase-Free Water                10 ml

                                    Shredder Spin Column               50

                                       Spin Column RM                50

                                  Collection Tube（1.5 ml）             50

                                   Collection Tube（2 ml）              100

產(chan) 品簡介

    本試劑盒適用於(yu) 從(cong) 新鮮全血（用檸檬酸鹽、EDTA 或肝素等抗凝劑處理過的血液樣品）中提取總  RNA，可以處理多至1.5  ml 的全血，洗脫得到分子量大於(yu) 200 bp 的高純度 RNA，多個(ge) 樣品可以在 1 小時內(nei) 同時完成。本產(chan) 品無需 CsCl 純化的超離心步驟和 LiCl 或乙醇沉澱，不含有苯酚或氯仿等有毒溶劑，經過純化的 RNA 有效去除血紅素、肝素等酶抑製劑和汙染物，可直接用於(yu) 各種分子生物學常規實驗，如 RT-PCR、Northern Blot、Dot Blot、體(ti) 外翻譯等實驗。

注意事項

1.  預防 RNase 汙染，應注意以下幾方麵：

1）  使用無 RNase 的塑料製品和槍頭，避免交叉汙染。

2）  玻璃器皿應在使用前於(yu) 180℃高溫下幹烤 4 小時，塑料器皿可在 0.5M NaOH 中浸泡 10 分鍾，用水*衝(chong) 洗後高壓滅菌。

3）  配製溶液應使用無 RNase 的水。

4）  操作人員戴一次性口罩和手套，實驗過程中要勤換手套。

2.  樣品應避免反複凍融，否則影響提取 RNA 提取得率和質量。樣品在 Buffer RL 中，可於(yu) -70℃保存一個(ge) 月。

3.  使用前請檢查 Buffer RL 是否出現結晶或者沉澱，可置於(yu) 56℃水浴重新溶解。Buffer RL 在使用前請加入β-巰基乙醇，

    至終濃度為(wei) 1%。如 1 ml Buffer RL 加 10 μl  β-巰基乙醇。加入β-巰基乙醇的 Buffer RL 室溫可保存 1 個(ge) 月。

4.  第一次使用前應按照試劑瓶標簽的說明先在 Buffer RW2 中加入無水乙醇。

5.  本試劑盒不能用於(yu) 加入抗凝劑的冷凍血液樣本 RNA  的提取。

6.  10×Buffer RBL 需在使用前將溶液用無 RNase 的水進行 10 倍稀釋，稀釋後置於(yu) 2-8℃保存。

7.  若下遊實驗對 DNA 非常敏感，建議用不含 RNase 的 DNase I（貨號：K2090A）對 RNA 進行處理。

自備試劑：  β-巰基乙醇、70%乙醇（用無 RNase 的水配製）、無水乙醇  

操作步驟

1.  向0.5-1.5 ml 新鮮的抗凝全血樣本中，加入5倍體(ti) 積的1×Buffer RBL（請於(yu) 使用前用無RNase的水將10×Buffer RBL 稀釋10倍），輕輕渦旋或顛倒混勻。冰上孵育10-15分鍾，孵育過程中混勻兩(liang) 次。

    注意：孵育過程中渾濁的懸液會(hui) 變成透明，證明紅細胞被裂解，必要時可以把孵育時間延長至20分鍾。

2.  4℃  2,100 rpm（~400×g）離心10分鍾，小心吸棄上清。

3.  向以上沉澱中加入2倍血液樣本體(ti) 積的1×Buffer  RBL（請於(yu) 使用前用無RNase的水將10×Buffer RBL稀釋10倍），輕輕渦旋，充分重懸沉澱。

4.  4℃  2,100 rpm離心10分鍾，小心並*吸棄上清。

    注意：此步一定要*去除上清否則影響裂解導致RNA產(chan) 量下降。

5. 向沉澱中加入Buffer RL（使用前檢查是否已經加入β-巰基乙醇），0.5-1.5 ml血液樣本加入600  μl Buffer RL，或小於(yu) 0.5 ml  血液樣本加入350 μl Buffer RL，混勻。

6.將所得液體(ti) 轉移到已裝入收集管（Collection Tube 2 ml）的過濾柱（Shredder Spin Column）中，12,000 rpm（~13,400×g）離心2分鍾，收集濾液，棄掉過濾柱。

7.向所得濾液中加入1倍體(ti) 積（600  μl或350 μl）的70%乙醇（無RNase水配製），混勻。

    注意：加入乙醇後可能會(hui) 產(chan) 生沉澱，不會(hui) 影響後續實驗。

8.將上步所得溶液全部加入到已裝入收集管（Collection Tube 2 ml）的吸附柱（Spin Column RM）中，若一次不能加完溶液，可分多次轉入。12,000 rpm離心15秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

9.  向吸附柱中加入700  μl Buffer RW1，12,000 rpm離心15秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

    可選步驟：如果要進行對微量DNA非常敏感的RNA實驗，則用以下步驟替代步驟9。

    1）向吸附柱中加入350  μl Buffer RW1, 12,000 rpm離心15秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

    2）配製DNase I  混合液：取52 μl RNase-Free Water，向其中加入8  μl 10×Reaction Buffer 和20  μl DNase I（1 U/μl），混勻，  配製成終體(ti) 積為(wei) 80  μl 的DNase I混合液。

       注意:  以上體(ti) 係為(wei) 按照我公司產(chan) 品DNase I （K2090A）反應體(ti) 係進行配置，應用其他公司產(chan) 品請參考相應說明書(shu) 。

    3）向吸附柱中直接加入80 µl DNase I混合液，20-30℃孵育15分鍾。

    4）向吸附柱中加入350  μl Buffer RW1, 12,000 rpm離心15秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

10.  向吸附柱中加入500  μl Buffer RW2（使用前檢查是否已加入無水乙醇），12,000 rpm離心15秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

11.  重複步驟10。

12.  12,000 rpm離心2分鍾，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置於(yu) 室溫數分鍾，以*晾幹。

    注意：這一步的目的是將吸附柱中殘餘(yu) 的乙醇去除，乙醇的殘留會(hui) 影響後續的酶促反應（酶切、PCR  等）。

13.  將吸附柱置於(yu) 一個(ge) 新的無RNase離心管（Collection Tube 1.5 ml）中，向吸附柱的中間部位加入30-50 μl RNase-Free

    Water，室溫放置1分鍾，12,000 rpm離心1分鍾，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。

注意：1）RNase-Free Wate體(ti) 積不應小於(yu) 30  μl，體(ti) 積過小影響回收率。

2）如果要提高RNA的產(chan) 量，可用30-50  μl新的RNase-Free Water重複步驟13。

3）如果要提高RNA濃度，可將得到的溶液重新加入到吸附柱中，重複步驟13。

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