TB基因分型試劑盒HV-3說明書(shu)

TB Typing Kit HV-3

TB基因分型試劑盒HV-3說明書(shu)

目錄號：K2571

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組分說明

應用                    Cat. No.        K2571-20       K2571-50

                        Kit Size             20          50

                         VNTR3820         400  μl       1 ml

高分辨3位點VNTR檢測   VNTR4120        400  μl        1 ml

                         VNTR3232         400  μl       1 ml

DNA 分子量標準 I        MarkerⅠ          120  μl      300  μl

DNA 分子量標準 II        MarkerⅡ         100  μl      250  μl

其它相關(guan) 產(chan) 品  YJ2570 TB基因分型試劑盒 VNTR-9

產(chan) 品簡介

    本試劑盒是以分子流行病學新的研究進展1）為(wei) 基礎，經工藝優(you) 化後形成的人型結核分枝杆菌基因分型產(chan) 品。本產(chan) 品利用結核分枝杆菌基因組中可變數目串聯重複序列（variable-number tandem repeats, VNTR）多態性進行基因型分型區分臨(lin)                                                床菌株，是研究結核分枝杆菌分子流行病學和監測結核病傳(chuan) 播狀況的有力工具。與(yu) 現有其它基於(yu) VNTR原理的結核分枝杆菌VNTR分型係統相比，這一分型係統對中國流行的菌株具有更強的分辨能力1，2，3），因此特別適合於(yu) 中國用戶的需求。

    通過對各PCR反應引物序列和預混反應液成份進行精心優(you) 化，使得本產(chan) 品具有很強的抗幹擾力。與(yu) 用戶自配試劑相比，本產(chan) 品顯著提升了特異條帶信號強度，降低了使用粗製模板（煮沸菌液）時非特異條帶的出現率，使實驗操作更加簡便、快捷的同時，提高了檢測成功率。本產(chan) 品的預混反應液化學穩定性良好，能有效抵抗反複凍融（10次）和較長時間（一周）的室溫環境，更好地適應了用戶檢測工作中的靈活性需求。

     本試劑盒是 TB 基因分型試劑盒 VNTR-9（貨號 K2570）的配套產(chan) 品。對 VNTR-9 試劑盒鑒定為(wei) 成簇或相同菌株的樣本，如有必要，可使用本產(chan) 品做更精細的進一步分型鑒定。本產(chan) 品中的 3 個(ge) 高分辨率檢測位點 VNTR3820，VNTR4120和VNTR3232 與(yu) VNTR-9 中的 9 個(ge) 檢測位點結合使用可將檢測的分辨率指數（Hunter-Gaston index，HGI)提升至 0.993                                                                                                                1）

參考文獻

1） Luo T et al. Development of a hierarchical variable-number tandem repeat typing scheme for Mycobacterium

    tuberculosis in China. PLoS One. 2014 Feb 25;9(2)

2） Sun G et al. Discriminatory potential of a novel set of Variable Number of Tandem Repeats for genotyping

    Mycobacterium marinum. Vet Microbiol. 2011 Aug 26;152(1-2)

3） Zhang L et al. Highly polymorphic variable-number tandem repeats loci for differentiating Beijing genotype

    strains of Mycobacterium tuberculosis in Shanghai, China. FEMS Microbiol Lett. 2008 May;282(1):22-31.

注意事項

1.  本產(chan) 品是 TB 基因分型試劑盒 VNTR-9（貨號 K2570）的配套產(chan) 品。待測菌株應先經過 VNTR-9 分型檢測，再使用  本產(chan) 品檢測。且本產(chan) 品的檢測結果應與(yu) VNTR-9 的檢測結果進行整合分析。

2.  為(wei) 避免汙染，建議製備生物時與(yu) 配製 PCR Mix 在不同的地點內(nei) 進行，並使用不同的移液器。

3.  在樣本 DNA 的收集，抽提和擴增的所有環節都應注意作好標記，同時防止不同樣本間發生交叉汙染。

4.  常用試劑和耗材在實驗前需高壓滅菌。

5.  每管 PCR Mix 中均含有不同的引物，不可混用。可根據實驗需求一次性分裝為(wei) 不同的量，避免反複凍融。

6.  為(wei) 避免打開反應管時，反應液飛濺，開蓋前請短暫離心，收集液體(ti) 於(yu) 管底。若不小心濺到手套或桌麵上，應立刻更換手套並用 75%酒精或稀酸擦拭桌麵。

7.  吸取時注意不要交叉汙染 PCR Mix，建議每次取 Mix 前用 75%酒精擦拭移液器頭 2 次。

8.  實驗前準備：1×TE  緩衝(chong) 液（PH=8.0）、0.5×TBE 緩衝(chong) 液、瓊脂糖、溴化乙錠（EB）、普通 PCR 儀(yi) 、DNA 電泳設備和凝膠成像儀(yi) 、0.2 ml PCR 反應管、八聯排或 96 孔 PCR 管、不同規格的移液器：0.5-10 μl 和 20-200 μl。

操作步驟

1.  DNA 模板製備：

1.1  從(cong) 固體(ti) 培養(yang) 基上刮取少量(1-2 接種環)樣本，重懸於(yu) 100 ul TE 中，80°C 滅活 30 分鍾。

1.2  滅活後的菌株拿出 P3 實驗室進行如下操作：

     100°C 煮沸 10 分鍾(煮沸時注意避免 EP 管蓋子爆開，避免讓水進入管中)，立即置於(yu) 冰上 2 分鍾，12,000 rpm (~13,400×g)離心 10 分鍾，取上清置於(yu) 另一無菌 EP 管中，做上標記，-20°C 保存。

2 .  檢測程序：

2.1  取出 TB 基因分型試劑盒 HV-3，待液體(ti) 平衡到室溫後，輕微搖晃 3-4 次混勻，然後 12,000 rpm (~13,400×g)離心5秒，使蓋上的液體(ti) 回落到管內(nei) 。                                                                                                    2.2  三位點 VNTR 分型：對於(yu) 12 位點結果相同的菌株需進一步進行 VNTR 分型，即增加以下 4 個(ge) 位點進行比較。

1）PCR 擴增：反應體(ti) 係為(wei) 20 μl。

   在每個(ge) PCR 管裏分別加入 19 μl VNTR3820、VNTR4120、VNTR3232 的  PCR Mix，加入 1 μl DNA 模板，混勻。

2）擴增條件：

a .  VNTR3820：

                           步驟          溫度            時間

                         預變性         95℃           10 min

                         變性            94℃         30 s

                        退火             58℃         30 s      30 個(ge) 循環

                        延伸             72℃         90 s

                        終延伸           72℃        7 min

b.  VNTR3232、VNTR4120：

                        步驟             溫度            時間

                     預變性             95℃              10 min

                    變性               94℃              30 s

                    退火                64℃           30 s   30 個(ge) 循環

                   延伸               72℃                90 s

                   終延伸             72℃               7 min

3）製膠、電泳：

   a：注意事項：  

   重要！每次實驗需要設置陽性（H37Rv 菌株 DNA）和陰性對照（去離子水）。

   關(guan) 鍵！本實驗是以瓊脂糖凝膠電泳為(wei) 基礎來判讀 VNTR 位點基因型，因此，為(wei) 了使結果準確，在電泳這一步必須要按照統一的標準操作，應注意以下幾點：

   a-1：製膠所用梳子為(wei) 18 孔。

   a-2：凝膠左右邊上的兩(liang) 個(ge) 孔由於(yu) 在電泳過程中容易使條帶變形，影響結果判讀，舍棄不用，或者在其中一個(ge) 孔點上陰性對照。剩餘(yu) 16 孔分為(wei) 12 個(ge) 樣本，3 個(ge) DNA Marker 和 1 個(ge) 陽性對照。點樣順序分別為(wei) “1，2，M，3，4，5，

         6，  M，7，8，9，10，M，11，12，H37Rv”，數字代表樣本，M 代表 DNA Marker。

   a-3：PCR 擴增產(chan) 物進行首次電泳並使用 Marker I 時，凝膠濃度為(wei) 1%，電壓為(wei) 150V，時間為(wei) 100-120 分鍾。

   a-4：如果擴增產(chan) 物片段過大（>1000bp），需要再次電泳並使用 Marker II 時，凝膠濃度為(wei) 0.8%，電壓 150V，時間為(wei) 150 分鍾。

   b：製膠以及電泳過程：

   使用 1%的瓊脂糖凝膠對 PCR 擴增產(chan) 物進行電泳。

   配製 1%的瓊脂糖凝膠，12×12 cm 膠盤製膠，每塊膠為(wei) 80 ml。

   b-1：稱取 0.8 g 瓊脂糖，加入 80 ml 0.5×TBE，在天平上稱重後放入微波爐，高火加熱 2-3 分鍾，使瓊脂糖*溶化，搖勻，觀察為(wei) 均一透明溶液，無顆粒，再在天平稱量，補入適量的雙蒸水，以保持膠的濃度不受影響。

   b-2：待融化的凝膠冷卻至 55℃左右時加入 4 μl 溴化乙錠（10 ug/ml），輕輕旋轉以充分混勻。用 18 齒的梳子製膠，將溫熱的凝膠澆灌入 12×12 cm 膠盤。

   b-3：待凝膠*凝結（室溫下放置 40 分鍾），小心拔出梳子，取出托盤，放入電泳槽中。電泳槽中加入 0.5×TBE 緩衝(chong) 液，沒過膠麵 1-2 mm。

   b-4：上樣電泳：每塊膠中加入 12 個(ge) 樣本（最邊上的孔不加樣），每個(ge) 孔中加入 3-5 μl PCR 產(chan) 物，同時每塊膠上加三個(ge) 5 μl DNA MarkerⅠ。電壓 150V，電泳時間為(wei) 100-120 分鍾。本步驟是各位點最終讀數是否準確的關(guan) 鍵，需要統一按照此標準操作。

   b-5：部分位點在臨(lin) 床菌株中存在擴增產(chan) 物大於(yu) 1000 bp 的情況，對這些擴增產(chan) 物再利用 0.8%瓊脂糖凝膠進行電泳，同時加入 DNA Marker II 作為(wei) 條帶大小對照，電壓 150V，電泳時間 150 分鍾。

4）結果顯示：

MarkerⅠ  

MarkerⅡ

5）結果分析：

   a.  如果不同菌株的 3 個(ge) 高變位點基因型也相同，可確定為(wei) 成簇菌株；

   b.  如果高變位點讀數高度相似，即隻有 1-2 個(ge) 高變位點有差別，需結合流行病學數據鑒定是否為(wei) 成簇菌株；

   c.  如果 3 個(ge) 高變位點基因型都不一致，鑒定為(wei) 單一菌株。

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