磺胺五合一

快速檢測試劑盒說明書(shu)

一、原理

本試劑盒采用間接競爭(zheng) ELISA方法，在微孔條上預包被偶聯抗原，樣本中的殘留物磺胺類藥物將和微孔條上預包被的偶聯抗原競爭(zheng) 抗磺胺類藥物抗體(ti) ，加入酶標記物後，用TMB底物顯色，樣本吸光值與(yu) 其所含殘留物磺胺類藥物的含量成負相關(guan) ，與(yu) 標準曲線比較即可得出相應殘留物磺胺類藥物的含量。

二、試劑盒特性

u 試劑盒靈敏度：   1ppb

u 孵育溫度：       25℃

u 孵育時間：       30min~15min

u 樣本檢測下限

組 織（高 檢 測 限 方 法）  ·············   1ppb

組 織（低 檢 測 限 方 法）  ··············   5 ppb

蜂 蜜 ··············································   1ppb

血 清 、 尿 液  ······························   4 ppb

牛    奶  ······································   20 ppb

u 交叉反應率

磺胺嘧啶（SD或SDZ）  ·····················  100.0%

磺胺間甲氧嘧啶/磺胺六甲氧嘧啶（SMM）····97.6%

磺胺甲噁唑（SMZ）  ····························  100%

磺胺噻唑（ST）  ································  195.0%

磺胺甲基嘧啶（SM₁ ）  ························   92%

u 樣本回收率

組  織 、尿 樣、牛 奶  ···············   85% ±25%

蜂 蜜、血 清  ···························   80% ±23%

三、試劑盒組成

四、所用儀(yi) 器、試劑

具備的儀(yi) 器：酶標儀(yi) 、均質器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）、氮吹儀(yi) 、恒溫箱

微量移液器：單道 20~200µl、單道100~1000µl、多道 30~300 µl

試      劑：乙酸乙酯、乙腈、二氯甲烷、正己烷、Na₂HPO₄·12H₂O、一水合檸檬酸、濃鹽酸、NaOH

五、樣本前處理步驟

u 樣本處理前須知

（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。

（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否幹淨，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免汙染幹擾實驗結果。

u 樣本前處理需配製：

配液1   0.2M NaOH溶液

稱取0.8gNaOH用去離子水100ml溶解。

配液2   0.5M鹽酸溶液

4.3ml濃鹽酸加入去離子水定容至100ml混勻。

配液3   Na₂HPO₄-檸檬酸緩衝(chong) 液

稱取19.85gNa₂HPO₄·12H₂O與(yu) 9.3g一水合檸檬酸，加去離子水定容至1L混勻。

配液4   乙腈-二氯甲烷混合溶液：

         V_乙腈：V_二氯甲烷  =  1 : 4

配液5   樣本複溶液：

將20X濃縮複溶液用去離子水1：19稀釋。

u 樣本處理：

（a）組織高檢測限處理方法一

1、 稱2.0±0.05g 均質過的組織樣本於(yu) 50ml離心管中；加入6ml乙酸乙酯，振蕩2min，4000r/min以上，15℃離心10min；

2、 取3ml清澈有機相至幹燥容器中，50-60℃氮氣或空氣吹幹；

3、 用1ml樣本複溶液溶解幹燥的殘留物，加入正己烷1ml。混合30s，4000r/min以上15℃離心5min；去除上層正己烷；

4、 取下層50µl液體(ti) 用於(yu) 分析。

樣本稀釋倍數:  1倍 

（b）組織高檢測限處理方法二

1、稱2.0±0.05g 均質過的組織樣本於(yu) 50ml離心管中；

2、加入乙腈-二氯甲烷混合溶液8ml，振蕩5min，4000r/min以上，15℃離心10min；

3、取4ml有機相至幹燥容器中，56℃氮氣吹幹/旋轉蒸發至幹；

4、用1ml樣本複溶液溶解幹燥的殘留物，加入正己烷1ml混合30s，4000r/min以上15℃離心5min；

5、去除上層正己烷，取下層50µl液體(ti) 用於(yu) 分析。

樣本稀釋倍數： 1倍 

   注：此方法與(yu) 喹諾酮類組織前處理方法二合一。

（c）組織低檢測限處理方法

1、 稱2.0±0.05g 均質過的組織樣本於(yu) 50ml離心管中；加入8ml 樣本複溶液，震蕩2min；4000r/min以上，15℃離心10min；

2、 取50µl液體(ti) 用於(yu) 分析。

    樣本稀釋倍數:  5倍 

（d）血清處理方法

1、 將血樣本於(yu) 室溫放置30min，於(yu) 10℃，4000r/min以上離心10min，分離出血清或過濾血清；

2、 取1ml血清，加入3ml 樣本複溶液混合，混合30s；

3、 取50µl液體(ti) 用於(yu) 分析。

樣本稀釋倍數:  4倍 

（e）蜂蜜處理方法

1、 稱取1±0.05g蜂蜜樣本於(yu) 50ml離心管中，加入1ml 0.5M 鹽酸溶液置於(yu) 37℃環境中30min；

2、 分別加入2.5ml 0.2M NaOH溶液和3ml Na₂HPO₄-檸檬酸緩衝(chong) 液，再加入4ml乙酸乙酯振蕩2min，4000r/min以上室溫離心10min；

3、 取2ml上層有機相於(yu) 50-60℃下氮氣吹幹，加入0.5ml 樣本複溶液複溶，混合30s；

4、 取50µl液體(ti) 用於(yu) 分析。

樣本稀釋倍數:  1倍  

（f）尿液處理方法

1、 用3ml樣本複溶液與(yu) 1ml經離心後的清亮尿樣本混合，混合30s；

2、 取50µl液體(ti) 用於(yu) 分析。

樣本稀釋倍數:  4倍

（g）牛奶處理方法

1、 取1ml牛奶樣本用樣本複溶液按1︰19（v/v）稀釋（即20µl牛奶+380µl 樣本複溶液），混合30s；

2、 取50µl液體(ti) 用於(yu) 分析。

樣本稀釋倍數:  20倍

六、 酶標免疫分析程序:

u 測定前應須知：

1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20～25℃）。

2、 使用之後立即將所有試劑放回2～8℃。

3、 在ELISA分析中的再現性，很大程度上取決(jue) 於(yu) 洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。

4、 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。

u 操作步驟：

1、 從(cong) 2～8℃冷藏環境中取出所需試劑，室溫（20～25℃）平衡30min以上，注意每種液體(ti) 試劑使用前均須搖勻。

2、 取出框架及需要數量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存於(yu) 2-8℃。

3、 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配製洗滌液。

4、 編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個(ge) 樣本和標準品做2孔平行，並記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

5、 加標準品/樣品50µl/孔到各自的微孔中，加入酶標記物50µl/孔，然後再加入抗體(ti) 工作液50µl/孔，用蓋板膜封板，25℃環境中反應30min。

6、 將孔內(nei) 液體(ti) 甩幹，用已稀釋的洗滌液250µl/孔洗板4～5次，每次間隔15～30秒，用吸水紙拍幹（拍幹後未清除的氣泡可用幹淨的槍頭刺破）。

7、 顯色：加入底物A液50µl/孔，再加入底物B液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環境中避光顯色15min。

8、 測定：加入終止液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀(yi) 於(yu) 450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，5min內(nei) 讀數），測定每孔OD值。

七、結果判定

結果判定有兩(liang) 種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與(yu) 其所含磺胺類藥物量成負相關(guan) 。

1、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與(yu) 標準值比較即可得出其濃度範圍(ng/ml)。假設樣本1的吸光度值為(wei) 0.3，樣本2的吸光度值為(wei) 1.0，標準液吸光度值分別是：0ppb為(wei) 2.243； 1ppb為(wei) 1.816；3ppb為(wei) 1.415；9ppb為(wei) 0.74；27ppb為(wei) 0.313；81ppb為(wei) 0.155。則樣本1的濃度範圍是27ppb～81ppb；樣本2的濃度範圍是3ppb～9ppb，乘以其對應的稀釋倍數即為(wei) 樣本中磺胺類藥物實際濃度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等於(yu) 標準品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個(ge) 標準（0標準）的吸光度值，再乘以100%，即

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值

（2）標準曲線的繪製與(yu) 計算

以標準品百分吸光率為(wei) 縱坐標，以磺胺類藥物標準品濃度（ng/ml）的半對數為(wei) 橫坐標，繪製標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從(cong) 標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為(wei) 樣本中磺胺類藥物實際濃度。

若利用試劑盒專(zhuan) 業(ye) 分析軟件進行計算，更便於(yu) 大量樣本的準確、快速分析。（歡迎來電索取）

八、 注意事項

1、 室溫低於(yu) 25℃或試劑及標本未回到室溫（20～25℃）會(hui) 導致所有標準的OD值偏低。

2、 在洗板過程中如果出現板孔幹燥的情況，則會(hui) 伴隨著標準曲線不成線性，重複性不好的現象。所以洗板拍幹後應立即進行下一步操作。

3、 混合要均勻，否則會(hui) 出現重複性不好的現象。

4、 反應終止液為(wei) 2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會(hui) 引起靈敏度、OD值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、 不用的微孔板放進自封袋重新密封；標準物質和無色的發色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、 顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。標準品1的吸光度值小於(yu) 0.5時，表示試劑可能變質。

8、 該試劑盒最佳反應溫度為(wei) 25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。

九、儲(chu) 藏條件和保質期

1、 儲(chu) 藏條件：試劑盒於(yu) 2～8℃保存，不要冷凍。

2、 保 質 期：該產(chan) 品有效期為(wei) 1年，生產(chan) 日期見包裝盒。

提示：酶標板真空包裝袋若有漏氣，酶標板仍然正常有效，不影響實驗結果，請放心使用。

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