過氧化物酶(POD)活性檢測試劑盒說明書(shu)

微量法

注意：正式測定之前選擇 2-3 個(ge) 預期差異大的樣本做預測定。

規格：100T/96S 產(chan) 品內(nei) 容：

提取液：液體(ti) 100mL×1 瓶，4℃保存； 試劑一：液體(ti) 20mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：液體(ti) 0.2mL×1 瓶，4℃保存；用時加入 3mL 試劑一，現配現用，可 4℃保存一周； 試劑三：液體(ti) 3 mL×1 瓶，4℃保存。

產(chan) 品說明：

POD（EC 1.11.1.7）廣泛存在於(yu) 動物、植物、微生物中，可催化過氧化氫氧化酚類和胺類化合物，具有消除過氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用。POD 在有過氧化氫存在的情況下，能使愈創木酚發生氧化，生成茶褐色物質，該物質在 470nm 有最大光吸收。

需自備的儀(yi) 器和用品：

可見分光光度計/酶標儀(yi) 、台式離心機、可調式移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水

操作步驟：

一、粗酶液提取：

1、細菌、細胞或組織樣品的製備

收集細菌或細胞到離心管內(nei) ，離心後棄上清；按照每 500 萬(wan) 細菌或細胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細菌或細胞（功率 20％，超聲 3s，間隔 10s，重複 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液進行冰浴勻漿；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。二、測定步驟：

1、 分光光度計或酶標儀(yi) 預熱 30min 以上，調節波長至 470nm，蒸餾水調零。

2、 測定前將試劑一、二和三在 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）放置 10min 以上。

3、 樣本測定表

在 EP 管中按順序加入上述試劑，立即混勻並計時，立即取 200µL 轉移至微量玻璃比色皿或 96

孔板中，記錄 470nm 下 30s 時的吸光值 A1 和 1min30s 後的吸光值 A2。計算∆A＝A2-A1。

POD 活性計算：

用微量玻璃比色皿測定的計算公式如下

1、按血清（漿）體(ti) 積計算

單位定義(yi) ：每 mL 血清（漿）在每 mL 反應體(ti) 係中每分鍾 A470 變化 0.01 定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

POD（U/mL）＝∆A÷0.01×V 反總÷V 樣÷T =4900×∆A

2、按樣本蛋白濃度計算

單位定義(yi) ：每 mg 組織蛋白在每 mL 反應體(ti) 係中每分鍾 A470 變化 0.01 定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

POD（U/mg prot）＝∆A÷0.01×V 反總÷（Cpr×V 樣）÷T =4900×∆A÷Cpr 3、按樣本鮮重計算

單位定義(yi) ：每 g 組織在每 mL 反應體(ti) 係中每分鍾 A470 變化 0.01 定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

POD（U/g 鮮重）＝∆A÷0.01×V 反總÷（W÷V 樣總×V 樣）÷T =4900×∆A÷W 4、按細菌或細胞數量計算

單位定義(yi) :每 1 萬(wan) 個(ge) 細菌或細胞在每 mL 反應體(ti) 係中每分鍾 A470 變化 0.01 定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

POD（U/104 cell）＝∆A÷0.01×V 反總÷（500÷V 樣總×V 樣）÷T =9.8×∆A

用 96 孔板測定的計算公式如下

1、按血清（漿）體(ti) 積計算

單位定義(yi) ：每 mL 血清（漿）在每 mL 反應體(ti) 係中每分鍾 A470 變化 0.005 定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

POD（U/mL）＝∆A÷0.005×V 反總÷V 樣÷T =9800×∆A

2、按樣本蛋白濃度計算

單位定義(yi) ：每 mg 組織蛋白在每 mL 反應體(ti) 係中每分鍾 A470 變化 0.005 定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

POD（U/mg prot）＝∆A÷0.005×V 反總÷（Cpr×V 樣）÷T =9800×∆A÷Cpr 3、按樣本鮮重計算

單位定義(yi) ：每 g 組織在每 mL 反應體(ti) 係中每分鍾 A470 變化 0.005 定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

POD（U/g 鮮重）＝∆A÷0.005×V 反總÷（W÷V 樣總×V 樣）÷T =9800×∆A÷W 4、按細菌或細胞數量計算

單位定義(yi) ：每 1 萬(wan) 個(ge) 細菌或細胞在每mL 反應體(ti) 係中每分鍾A470 變化 0.005 定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

POD（U/104 cell）＝∆A÷0.005×V 反總÷（500÷V 樣總×V 樣）÷T =19.6×∆A

V 反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，0.245mL；V 樣：加入樣本體(ti) 積，0.005mL；V 樣總：加入提取液體(ti) 積，1 mL；T：反應時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g；500：細菌或細胞總數，500 萬(wan) 。

注意事項：

1、 如一次測定的樣本數量較多，可將試劑一、二、三和蒸餾水按照比例混合，在 37℃（哺乳動物） 或

25℃（其它物種）放置 10min，測定時加入 240µL 即可。

2、 樣本測定值如果小於(yu) 0.005，可將反應時間延長到 3-5 分鍾，計算時除以反應時間即可；如果高於(yu) 0.5，可將樣本用提取液進行稀釋。計算時乘以相應的稀釋倍數即可。

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