小鼠磷脂酰肌醇抗體(ti) IgM（PI Ab-IgM）ELISA試劑盒說明書(shu)

磷脂酰肌醇抗體(ti) IgM試劑盒用於(yu) 測定小鼠血清，血漿及相關(guan) 液體(ti) 樣本中磷脂酰肌醇抗體(ti) IgM（PI Ab-IgM）水平。

磷脂酰肌醇實驗原理：

  本試劑盒采用雙抗原夾心酶聯免疫法（ELISA）測定標本中小鼠磷脂酰肌醇抗體(ti) IgM（PI Ab-IgM）。用純化的小鼠磷脂酰肌醇抗體(ti) IgM（PI Ab-IgM）抗原包被微孔板，製成固相抗原，可與(yu) 樣品中磷脂酰肌醇抗體(ti) IgM（PI Ab-IgM）相結合，經洗滌除去未結合的抗原和其他成分後再與(yu) HRP標記的磷脂酰肌醇抗體(ti) IgM（PI Ab-IgM）抗原結合，形成抗原-抗體(ti) -酶標抗原複合物，經過*洗滌後加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，並在酸的作用下轉化成zui終的黃色。用酶標儀(yi) 在450nm波長下測定吸光度（OD值），與(yu) CUTOFF值相比較，從(cong) 而判定標本中小鼠磷脂酰肌醇抗體(ti) IgM（PI Ab-IgM）的存在與(yu) 否。

試劑盒組成：

試劑盒組成	48孔配置	96孔配置	保存
說明書(shu)	1份	1份
封板膜	2片（48）	2片（96）
密封袋	1個(ge)	1個(ge)
酶標包被板	1×48	1×96	2-8℃保存
陰性對照	0.5ml×1瓶	0.5ml×1瓶	2-8℃保存
陽性對照	0.5ml×1瓶	0.5ml×1瓶	2-8℃保存
酶標試劑	3 ml×1瓶	6 ml×1瓶	2-8℃保存
樣品稀釋液	3 ml×1瓶	6 ml×1瓶	2-8℃保存
顯色劑A液	3 ml×1瓶	6 ml×1瓶	2-8℃保存
顯色劑B液	3 ml×1瓶	6 ml×1瓶	2-8℃保存
終止液	3ml×1瓶	6ml×1瓶	2-8℃保存
濃縮洗滌液	（20ml×20倍）×1瓶	（20ml×30倍）×1瓶	2-8℃保存

樣本處理及要求：

1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鍾，離心20分鍾左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現沉澱，應再次離心。

2. 血漿：應根據標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為(wei) 抗凝劑，混合10-20分鍾後，離心20分鍾左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉澱形成，應該再次離心。

3. 尿液：用無菌管收集，離心20分鍾左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉澱形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。

4. 細胞培養(yang) 上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鍾左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。檢測細胞內(nei) 的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬(wan) /ml左右。通過反複凍融，以使細胞破壞並放出細胞內(nei) 成份。離心20分鍾左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉澱形成，應再次離心。

5. 組織標本：切割標本後，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化後仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鍾左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。分裝後一份待檢測，其餘(yu) 冷凍備用。

6. 標本采集後盡早進行提取，提取按相關(guan) 文獻進行，提取後應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放於(yu) -20℃保存，但應避免反複凍融.

7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑製辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

磷脂酰肌醇IgM操作步驟：

1.         編號：將樣品對應微孔按序編號，每板應設陰性對照2孔、陽性對照2孔、空白對照1孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其餘(yu) 各步操作相同）

2.         加樣：分別在陰、陽性對照孔中加入陰性對照、陽性對照50μl。然後在待測樣品孔先加樣品稀釋液50μl，然後再加待測樣品10μl。加樣將樣品加於(yu) 酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，

3.         溫育：用封板膜封板後置37℃溫育30分鍾。  

4.         配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液加蒸餾水至600ml後備用

5.         洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體(ti) ，甩幹，每孔加滿洗滌液，靜置30秒後棄去，如此重複5次，拍幹。

6.         加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。

7.         溫育：操作同3。

8.         洗滌：操作同5。

9.         顯色：每孔先加入顯色劑A 50μl，再加入顯色劑B 50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鍾

10.     終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。

11.     測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液後15分鍾以內(nei) 進行。

結果判定：

  試驗有效性：陽性對照孔平均值≥1.00; 陰性對照平均值≤0.10

  臨(lin) 界值（CUT OFF）計算：臨(lin) 界值=陰性對照孔平均值+0.15

  陰性判定：樣品OD值< 臨(lin) 界值（CUT OFF）者為(wei) 磷脂酰肌醇抗體(ti) IgM（PI Ab-IgM）陰性

  陽性判定：樣品OD值≥ 臨(lin) 界值（CUT OFF）者為(wei) 磷脂酰肌醇抗體(ti) IgM（PI Ab-IgM）陽性

注意事項

1．操作嚴(yan) 格按照說明書(shu) 進行，本試劑不同批號組分不得混用。

2．試劑盒從(cong) 冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鍾後方可使用，酶標包被板開封後如未用完，板條應裝入密封袋中保存。

3．濃洗滌液可能會(hui) 有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。

4．  封板膜隻限一次性使用，以避免交叉汙染。

5．底物請避光保存。

6．試驗結果判定必須以酶標儀(yi) 讀數為(wei) 準，使用雙波長檢測時，參考波長為(wei) 630nm

7．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳(chuan) 染物處理。終止液為(wei) 2M的硫酸，使用時必須注意安全。

保存條件及有效期

1．試劑盒保存：2-8℃。

2．有效期：6個(ge) 月