一氧化氮 (Nitric oxide ，NO) 含量測定試劑盒說明書(shu)

微量法

注意：正式測定之前選擇2-3個(ge) 預期差異大的樣本做預測定。

測定意義(yi) ：

NO  (Nitric Oxide ，NO) 廣泛分布於(yu) 生物體(ti) 內(nei) 神經、循環、呼吸、消化、泌尿生殖等係統 中，特別是神經組織中較豐(feng) 富。它作為(wei) 細胞間及細胞內(nei) 的信息物質，發揮信號傳(chuan) 遞的作用，是 一種新型的生物信使分子，在機體(ti) 的生理、病理過程中起著重要的作用。

測定原理：

NO在體(ti) 內(nei) 或水溶液中極易氧化生成 NO2-，在酸性條件下，NO2-與(yu) 重氮鹽磺酸胺生成重氮 化合物，進一步與(yu) 萘基乙烯基二胺偶合，產(chan) 物在550nm處有特征吸收峰，測定其吸光值，可以 計算NO含量。為(wei) 了排除樣品色素等的影響，每個(ge) 樣品需做對照管。

自備實驗用品及儀(yi) 器：

天平、研缽或勻漿器、可見分光光度計/酶標儀(yi) 、微量石英比色皿/96  孔板、蒸餾水。

試劑組成和配製：

提取液：液體(ti) 100mL×1  瓶，4℃保存。

試劑一：液體(ti) 3mL×1  瓶，4℃避光保存。

試劑二：液體(ti) 3mL×1  瓶，4℃保存。

試劑三：液體(ti) 6mL×1  瓶，4℃避光保存。

樣品處理：

1.  組織：按照組織質量 (g) ：提取液體(ti) 積(mL)為(wei) 1：5~ 10的比例 (建議稱取約0. 1g組織，加入 1mL提取液) 進行冰浴勻漿。10000g ，4℃離心 15min ，取上清，置冰上待測。

2.  細菌、真菌：按照細胞數量 (104個(ge) ) ：提取液體(ti) 積 (mL) 為(wei) 500~ 1000：1的比例 (建議500 萬(wan) 細胞加入1mL提取液) ，冰浴超聲波破碎細胞 (功率300w ，超聲3秒，間隔7秒，總時間 3min ) ；然後10000g ，4℃ ，離心 15min ，取上清置於(yu) 冰上待測。

3.  體(ti) 液和培養(yang) 液等其它液態樣品：直接測定。

測定步驟和操作表：

1 、  分光光度計或酶標儀(yi) 預熱30min 以上，調節波長至550nm。

2 、  操作表

NO  含量計算：

a.    用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標準曲線回歸方程為(wei) ：y=0.016x-0.0103 ，R2=0. 9986

1 、組織樣品：

NO含量定義(yi) ：25℃時，每克樣品或每毫克蛋白15min生成1μmoL NO2-，相當於(yu) 1μmoL NO。

(1) 按樣本質量計算

NO  含量 (μmoL/g) =  (A 550 +0.0103) ÷0.016×V  反總÷  (V  樣÷V  樣總×W) ×10 -3

= 0. 125×  (A 550 +0.0103) ÷W

(2) 按樣本蛋白濃度計算

NO  含量 (μmoL/mg prot) =  (A 550 +0.0103) ÷0.016×V  反總÷  (V  樣×Cpr) ×10 -3 = 0. 125×  (A 550 +0.0103) ÷Cpr

2 、其他樣品：

NO  含量定義(yi) ：25℃時，每升樣品15min生成 1μmoL NO2- ，相當於(yu) 1μmoL NO。 NO  含量 (μmoL/L) =  (A 550+0.0103) ÷0.016×V  反總÷V  樣

= 125×  (A 550+0.0103)

V  反總：反應總體(ti) 積，0.2mL；V  樣：反應中樣品體(ti) 積，0. 1mL；V  樣總：加入提取液體(ti) 積， 1mL；W：樣品質量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/mL

b.  用 96  孔板測定的計算公式如下

標準曲線回歸方程為(wei) ：y= 0.008x-0.0103 ，R2=0. 9986

1 、組織樣品：

NO含量定義(yi) ：25℃時，每克樣品或每毫克蛋白15min生成 1μmoL NO2-，相當於(yu) 1μmoL NO。 (1) 按樣本重量計算

NO  含量 (μmoL/g) =  (A 550 +0.0103) ÷0.008×V  反總÷  (V  樣÷V  樣總×W) ×10 -3

= 0.25×  (A 550+0.0103) ÷W

(2) 按樣本蛋白濃度計算

NO  含量 (μmoL/mg prot) =  (A 550+0.0103) ÷0.008×V  反總÷  (V  樣×Cpr) ×10 -3 = 0.25×  (A 550+0.0103) ÷ Cpr

2 、細胞

NO  含量定義(yi) ：25℃時，每104個(ge) 細胞15min  生成 1μmoL NO2- ，相當於(yu) 1μmoL NO。

NO  含量 (μmol/104cell) = (A 550+0.0103) ÷0.008×V反總÷ (V樣÷V樣總×細胞數量) ×10 -3= 0.25×  (A 550+0.0103) ÷細胞數量 (萬(wan) 個(ge) )

3 、  其他樣品：

NO  含量定義(yi) ：25℃時，每升樣品 15min  生成 1μmoL NO2- ，相當於(yu) 1μmoL NO。

NO  含量 (μmoL/L) =  (A 550 +0.0103) ÷0.008× V  反總÷V  樣= 250×  (A 550 +0.0103)   V  反總：反應總體(ti) 積，0.2mL；V  樣：反應中樣品體(ti) 積，0. 1mL；V  樣總：加入提取液體(ti) 積， 1mL；W：樣品質量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/mL

注意事項：

1.  試劑盒 2-8℃保存。

2.  盡量使用新鮮樣品進行檢測，試劑三有腐蝕性，操作時請做好防護措施。

3.  若檢測出得 OD  值在標準曲線範圍外，請將樣品進行適當的濃縮或稀釋，並在計算公式 中除以濃縮倍數或者乘以稀釋倍數。

4.  最DI檢出限為(wei) 0.65μmoL/L。

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