磷脂酶 A2（phospholipase A2，PLA2）試劑盒說明書(shu)

微量法

注意：正式測定之前選擇2-3個(ge) 預期差異大的樣本做預測定。

測定意義(yi)

磷脂酶A2（EC3.1.1.4）是磷脂sn-2位脂酰基水解酶，廣泛存在於(yu) 動植物組織、細菌、細胞核分泌物中，參與(yu) 脂肪消化，精子成熟、細胞信號傳(chuan) 遞、脂質過氧化修複、宿主反應等生理過程，在控製體(ti) 內(nei) 磷脂類物質平衡、調節機體(ti) 新陳代謝、參與(yu) 疾病的病理進程等方麵發揮著及其重要的作用。

測定原理

磷脂酶A2作用於(yu) 2-硫代十六酰乙基磷酸膽堿（HEPC）產(chan) 生遊離巰基，與(yu) DTNB反應生成黃色物質，在412nm處有特征吸收峰。

自備實驗用品及儀(yi) 器

天平、超速冷凍離心機、研缽、紫外分光光度計/酶標儀(yi) 、微量石英比色皿/96 孔板。

試劑組成和配製

提取液：液體(ti) 100mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體(ti) 100mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：液體(ti) 20mL×1 瓶，4℃保存。

試劑三：液體(ti) ×5 瓶，-20℃避光保存。臨(lin) 用前根據用量每瓶加入 1.8mL 試劑二充分混勻。(3天使用完)

樣品處理

1. 組織：按照質量（g）：提取液體(ti) 積(mL)為(wei) 1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿後於(yu) 4℃，10000g 離心5min，取全部上清於(yu) 4℃、100000g離心30min，棄上清，取沉澱溶於(yu) 1mL試劑一。

2. 細胞：按照細胞數量（10⁴個(ge) ）：提取液體(ti) 積（mL）為(wei) 500~1000：1的比例（建議500萬(wan) 細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然後於(yu) 4℃，10000g 離心5min，取全部上清於(yu) 4℃、100000g 離心 30min，棄上清，取沉澱溶於(yu) 1mL試劑一。

3. 血清：直接測定。

測定操作

計算公式

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1．按照蛋白濃度計算

酶活性定義(yi) ：每毫克蛋白每分鍾水解HEPC產(chan) 生1nmol遊離巰基所需的酶量為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

PLA2 活性（nmol/min/mg prot）= △A÷（ε×d）×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷T

= 73.53×△A÷Cpr

2．按照樣本質量計算

酶活性定義(yi) ：每克組織每分鍾水解HEPC產(chan) 生1nmol遊離巰基所需的酶量為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

PLA2 活性（nmol/min/g）= △A÷（ε×d）×V 反總÷（W×V 樣÷V 樣總）÷T

= 73.53×△A÷W

3. 細胞數量計算

酶活性定義(yi) ：每10⁴個(ge) 細胞每分鍾水解HEPC產(chan) 生1nmol遊離巰基所需的酶量為(wei) 一個(ge) 酶活力

單位。

PLA2 活性（nmol/min/10⁴cell）= △A÷（ε×d）×V 反總÷（V 樣×細胞數量÷V 樣總）÷T= 73.53×△A÷細胞數量

4 按照液體(ti) 體(ti) 積計算

酶活性定義(yi) ：每毫升血清每分鍾水解HEPC產(chan) 生1nmol遊離巰基所需的酶量為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

PLA2 活性（nmol/min/mL）= △A÷（ε×d）×V 反總÷V 樣÷T= 73.53×△A

ε：TNB 消光係數，13600L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V 反總：反應總體(ti) 積，1mL；V 樣：反應體(ti) 係中加入樣本體(ti) 積，0.1mL；W：樣本質量，g；V 樣總：加入提取液體(ti) 積，1mL；T：反應時間，10min

b. 用 96 孔板測定的計算公式如下

1．按照蛋白濃度計算

酶活性定義(yi) ：每毫克蛋白每分鍾水解HEPC產(chan) 生1nmol遊離巰基所需的酶量為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

PLA2 活性（nmol/min/mg prot）= △A÷（ε×d）×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷T

=147.06×△A÷Cpr

2．按照樣本質量計算

酶活性定義(yi) ：每克組織每分鍾水解HEPC產(chan) 生1nmol遊離巰基所需的酶量為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

PLA2 活性（nmol/min/g）= （ε×d）×V 反總÷（W×V 樣÷V 樣總）÷T

= 147.06×△A÷W

3. 細胞數量計算

酶活性定義(yi) ：每10⁴個(ge) 細胞每分鍾水解HEPC產(chan) 生1nmol遊離巰基所需的酶量為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

PLA2活性（nmol/min/10⁴cell）= △A÷（ε×d）×V 反總÷（V樣×細胞數量÷V樣總）÷T=147.06×△A÷細胞數量

4 按照液體(ti) 體(ti) 積計算

酶活性定義(yi) ：每毫升血清每分鍾水解HEPC產(chan) 生1nmol遊離巰基所需的酶量為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

PLA2 活性（nmol/min/mL）= △A÷（ε×d）×V 反總÷V 樣÷T

= 147.06×△A

ε：TNB 消光係數，13600L/mol/cm；d：比色皿光徑，0.5cm；V 反總：反應總體(ti) 積，1mL；V 樣：反應體(ti) 係中加入樣本體(ti) 積，0.1mL；W：樣本質量，g；V 樣總：加入提取液體(ti) 積，1mL；T：反應時間，10min

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