幾種 HRP 常用底物及其操作

底物範圍較廣，包括二氨基聯苯胺(DAB)、氯萘酚和氨乙基哢唑等。

二氨基聯苯胺／金屬鹽
DAB是辣根過氧化物酶最敏感、常用的底物。它產(chan) 生強烈的棕色產(chan) 物，在水和醇中不溶解。多數情況下，推薦在DAB中加入不同的金屬離子。當加入金屬鹽如鈷、鎳至底物液中，辣根過氧化物酶可以更加敏感。此類反應產(chan) 物呈暗藍灰色至黑色，且在水及醇中穩定。DAB／金屬鹽染色應用的組織染色範圍較廣。

   1．需要的溶液和特殊設備
   DAB，0．05mol／LTris緩衝(chong) 液(pH7．6)；
   0．3％(W／V)氯化鎳／水貯存液；
   30％過氧化氫；
   DPX。
   光學顯微鏡(通常帶有照相機以便於(yu) 記錄結果)
   2．操作步驟
   (1)用9ml 0．05mol／L Tris緩衝(chong) 液(pH7．6)溶解6mgDAB；
   (2)加lml 0．3％(W／V)氯化鎳／水貯存液(也可以用等量的氯化鈷替代)；
   (3)加0．1 m1 3％過氧化氫。過氧化氫一般以30％的溶液提供，貯存在4E，此條件可以持續1個(ge) 月；
   (4)如果出現沉澱，用濾紙過濾；
   (5)加此溶液至標本，並孵育1—20min水洗終止反應；
   (6)優(you) 化：如果需要可複染；
   (7)用DPX封片。

氯萘酚
   氯萘酚可以形成一種藍黑色產(chan) 物。敏感性低於(yu) DAB，且產(chan) 物可溶於(yu) 醇中。它適用於(yu) 當DAB反應形成較高背景或要求改變產(chan) 物的顏色。

   1.需要的溶液和特殊設備
   0，03％氯萘酚，用無水乙醇溶解(貯存在-20℃)，0．05mol／LTris(pH7．6)
   過氧化氫；
   Gelvatol或者Mowiol。
   光學顯微鏡(通常帶有照相機以便於(yu) 記錄結果)。

   2．操作步驟
   (1)氯萘酚貯存液的準備：用10ml無水乙醇溶解0．3g氯萘酚，貯存於(yu) —20℃；
   (2)加100ul氯萘酚貯存液至10ml 0．05mol／LTris(pH7．6)，
   (3)加0．1ml 3％過氧化氫於(yu) 水中。過氧化氫一般是以30％的溶液提供，4℃可存放1個(ge) 月；
   (4)白色沉澱可用濾紙過濾去除；
   (5)加此溶液到標本中，並在室溫孵育10～40min，水洗終止反應；
   (6)優(you) 化：如果需要，進行複染，但隻可使用水溶性染料；
   (7)用Gelvatol或者Mowiol封片。

氨乙基哢唑
   氨乙基哢唑(AEC)產(chan) 生紅色產(chan) 物，其敏感性低於(yu) DAB，但可用於(yu) DAB反應產(chan) 生較高背景或要求改變產(chan) 物顏色的試驗。此產(chan) 物可溶於(yu) 醇，但不溶於(yu) 水。

   1．需要的溶液和特殊設備
   0．4％AEC用N，N—二甲基甲酰胺(DMF)溶解；
   0．1mol／L乙酸鈉緩衝(chong) 液(pH5．2)；
   過氧化氫；
   Gelvatol或Mowi01．
   光學顯微鏡(通常帶有照相機以便於(yu) 記錄結果)。

   2．操作步驟
   (1)用lmlDMF溶解4mgAEC。AEC在DMF中穩定，因此，可以用100mlDMF溶解0．4gAEC作為(wei) 貯存液備用；
   (2)加lmlAEC溶液至15ml 0．1mol／L的乙酸鈉緩衝(chong) 液(pH5．2)中，並攪拌；
   (3)加0．15ml 3％過氧化氫於(yu) 水中。過氧化氫一般是30％的溶液提供，在4℃可存放1個(ge) 月；
   (4)用濾紙過濾；
   (5)加此溶液到標本中，並於(yu) 室溫孵育10～40min，水洗終止反應；
   (6)優(you) 化：如果需要複染，隻可用水溶性染料；
   (7)用Gelvatol或Mowiol封片。