BCA蛋白濃度檢測

一、實驗原理

BCA與(yu) 二價(jia) 銅離子的硫酸銅等其他試劑混合一起即為(wei) BCA工作試劑。在堿性條件下， BCA工作液與(yu) 蛋白質結合時，蛋白質將二價(jia) 銅離子還原為(wei) 一價(jia) 銅離子， 一個(ge) 一價(jia) 銅離子螯合兩(liang) 個(ge) BCA分子，工作試劑變色，在562nM處有高的光吸收值，並與(yu) 蛋白質濃度成正比，據此繪製標準曲線，檢測蛋白的OD值，即可得到濃度值。

二、應用範圍

1. BCA法測定蛋白濃度可以兼容樣品中高達5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween20、60、80。但本試劑盒受螯合劑和略高濃度的還原劑的影響，需確保EDTA低於(yu) 10mM，無EGTA，二硫蘇糖醇(DTT)低於(yu) 1mM，β-巰基乙醇(β-Mercaptoethanol)低於(yu) 0.01%。（tips：認真看說明書(shu) ， 不僅(jin) 是BCA檢測試劑盒說明書(shu) ， 還有蛋白裂解液說明書(shu) ， 清楚裂解液的試劑配方， 如果不適用BCA法，可以考慮其他方法測定蛋白濃度）

2. 靈敏度高， 檢測濃度下限達到25μg/ml，最小檢測蛋白量達到0.5μg，待測樣品體(ti) 積為(wei) 1-20μl。

3. 在50-2000μg/ml濃度範圍內(nei) 有較好的線性關(guan) 係，因此樣品濃度過高需適當稀釋。

三、實驗準備

1. BCA蛋白濃度測定試劑盒

2. PBS緩衝(chong) 液

3. 96孔板

4. 酶標儀(yi)

5. 37℃恒溫培養(yang) 箱

四、試劑配置

1. 蛋白標準品： 5mg/ml BSA

完全溶解蛋白標準品，取5mg/ml BSA蛋白標準品10μl，加入90μl的PBS稀釋為(wei) 0.5mg/ml BSA（Tips：稀釋後的0.5mg/ml BSA蛋白標準可以一次全配好，分裝後-20℃長期保存）。

2. BCA工作液配製

根據樣品數量和重複次數， 200μl每孔計算所需工作液的體(ti) 積。 BCA工作液按50體(ti) 積BCA試劑A加1體(ti) 積BCA試劑B(50:1)配製適量，充分混勻（Tips：由於(yu) 加樣誤差適當多配一些，配好的BCA工作液室溫在24小時內(nei) 穩定，因此可以在提蛋白前配好）。

五、實驗操作

1. 蛋白標準品濃度梯度配製

2. 加適當體(ti) 積樣品到96孔板的樣品孔中。如果樣品不足20μl，需加PBS補足到20μl。（Tips：記錄加入待檢測樣品的體(ti) 積）

3. 各孔加入200μl BCA工作液， 96孔板震蕩30sec，37℃恒溫培養(yang) 箱放置30分鍾。（Tips：也可以室溫放置2 小時。 BCA法測定蛋白濃度時，顏色會(hui) 隨著時間的延長不斷加深。並且顯色反應會(hui) 因溫度升高而加快。如果濃度較低，適合在較高溫度孵育，或適當延長孵育時間）

4. 用酶標儀(yi) 測定562nM的吸光度（Tips：也可以使用分光光度計測定）。

5. 以蛋白含量(μg）為(wei) 橫坐標，吸光值為(wei) 縱坐標，繪出標準曲線，根據標準曲線和使用的樣品體(ti) 積計算出樣品的蛋白濃度。

六、常見問題

1. 測定標準曲線時發現隨著標準品濃度的增加吸光度或顏色沒有明顯變化。可能的原因是樣品中含有嚴(yan) 重幹擾BCA法測定蛋白濃度的物質。

2. 建議每次測定時都做標準曲線。因為(wei) BCA法測定時顏色會(hui) 隨著時間的延長不斷加深，並且顯色反應的速度和溫度有關(guan) ，所以除非精確控製顯色反應的時間和溫度，否則如需精確測定宜每次都做標準曲線。

3. 一般提取的蛋白濃度應該在多少μg/μl？組織在1-30μg/μl，細胞低一些大概0.1-10μg/μl。

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