人神經絲(si) 蛋白（NF）ELISA試劑盒說明書(shu)

本試劑僅(jin) 供研究使用       目的：本試劑盒用於(yu) 測定人血清，血漿及相關(guan) 液體(ti) 樣本中神經絲(si) 蛋白（NF）含量。

實驗原理：

    本試劑盒應用雙抗體(ti) 夾心法測定標本中人神經絲(si) 蛋白（NF）水平。用純化的人神經絲(si) 蛋白（NF）抗體(ti) 包被微孔板，製成固相抗體(ti) ，往包被單抗的微孔中依次加入神經絲(si) 蛋白（NF），再與(yu) HRP標記的神經絲(si) 蛋白（NF）抗體(ti) 結合，形成抗體(ti) -抗原-酶標抗體(ti) 複合物，經過*洗滌後加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，並在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的神經絲(si) 蛋白（NF）呈正相關(guan) 。用酶標儀(yi) 在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中人神經絲(si) 蛋白（NF）濃度。

試劑盒組成：

樣本處理及要求：

1.血清：室溫血液自然凝固10-20分鍾，離心20分鍾左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現沉澱，應再次離心。

2.血漿：應根據標本的要求選擇EDTA、者檸檬酸鈉或肝素作為(wei) 抗凝劑，混合10-20分鍾後，離心20分鍾左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉澱形成，應該再次離心。

3.尿液：用無菌管收集，離心20分鍾左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉澱形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。

4.細胞培養(yang) 上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鍾左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。檢測細胞內(nei) 的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬(wan) /ml左右。通過反複凍融，以使細胞破壞並放出細胞內(nei) 成份。離心20分鍾左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉澱形成，應再次離心。

5.組織標本：切割標本後，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化後仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鍾左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。分裝後一份待檢測，其餘(yu) 冷凍備用。

操作步驟

1. 標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設標準品孔10孔，在*、第二孔中分別加標準品100μl，然後在*、第二孔中加標準品稀釋液50μl，混勻；然後從*孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻；然後在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，再各取50μl分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul，混勻；混勻後從第五、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl，混勻後從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻後從第九第十孔中各取50μl棄掉。（稀釋後各孔加樣量都為50μl，濃度分別為300ng/L，200ng/L ，100ng/L，50ng/L，25ng/L）。
2. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其餘各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然後再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加於酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
3. 溫育：用封板膜封板後置37℃溫育30分鍾。
4. 配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋後備用。
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩幹，每孔加滿洗滌液，靜置30秒後棄去，如此重複5次，拍幹。
6. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。
7. 溫育：操作同3。
8. 洗滌：操作同5。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鍾.
10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。
11. 測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液後15分鍾以內進行。

注意事項：

1. 試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鍾後方可使用，酶標包被板開封後如未用完，板條應裝入密封袋中保存。
2. 濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。
3. 各步加樣均應使用加樣器，並經常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間控製在5分鍾內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。
4. 請每次測定的同時做標準曲線，做複孔。如標本中待測物質含量過高（樣本OD值大於標準品孔*孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n倍）後再測定，計算時請zui後乘以總稀釋倍數（×n×5）。
5. 封板膜隻限一次性使用，以避免交叉汙染。
6. 底物請避光保存。
7. 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.
8. 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
9. 本試劑不同批號組分不得混用。

計算：

以標準物的濃度為(wei) 橫坐標，OD值為(wei) 縱坐標，   

在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD     

值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋      

倍數；或用標準物的濃度與(yu) OD值計算出標      

準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值      

代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋      

倍數，即為(wei) 樣品的實際濃度。

試劑盒性能：

1.樣品線性回歸與(yu) 預期濃度相關(guan) 係數R值為(wei) 0.95以上。

2.批內(nei) 與(yu) 批見應分別小於(yu) 9%和11%

保存條件及有效期：

1.試劑盒保存：；2-8℃。

2．有效期：6個(ge) 月