PCR需要注意的一些問題
擴增長目的片段當擴增大於(yu) 5kb的目的片段時，可以使用用於(yu) 超長PCR的酶或酶混合物以獲得*產(chan) 量）。Taq DNA聚合酶並不能有效擴增較長目的片段（大於(yu) 5kb），可能是因為(wei) 其缺少3'-5'外切核酸酶活性，不能糾正dNTP錯誤摻入。錯誤配對的延伸幾率大大降低，減少了較長產(chan) 物的產(chan) 量。將Taq DNA聚合酶同帶有3'-5'外切核酸酶活性的熱穩定DNA聚合酶混合，可以擴增zui高為(wei) 30kb的目的片段。Platunum Pfx DNA聚合酶（帶有3'-5'外切核酸酶活性）也可以擴增較長產(chan) 物（≤12kb）。除了選用正確的熱穩定DNA聚合酶，較長產(chan) 物的擴增還需要改變標準步驟的延伸時間、變性時間、緩衝(chong) 液pH。按1分鍾/kb增加延伸時間使聚合酶完成合成。一般對於(yu) 有效的超長PCR，延伸溫度會(hui) 低至68℃。因為(wei) 延伸時間較長，對於(yu) 20kb的模板高達20分鍾，所有使用較高起始pH的緩衝(chong) 液。如果pH將至低於(yu) pH7.0，DNA會(hui) 脫嘌呤。為(wei) 了防止模板損傷(shang) ，在每個(ge) 循環將94℃變性時間減少到30秒或更短，將在擴增前溫度增加到94℃變性溫度的時間限製為(wei) 小於(yu) 等於(yu) 1分鍾。引物使用標準方法所使用的同樣的方法設計，使用18到24個(ge) 堿基得到較好的產(chan) 量。防止殘餘(yu) （Carry-over）汙染PCR易受汙染的影響，因為(wei) 它是一種敏感的擴增技術。小量的外源DNA汙染可以與(yu) 目的模板一塊被擴增。當前一次擴增產(chan) 物用來進行新的擴增反應時，會(hui) 發生共同來源的汙染。這稱之為(wei) 殘餘(yu) 汙染。從(cong) 其他樣品中純化的DNA或克隆的DNA也會(hui) 是汙染源。可以在PCR過程中使用良好的實驗步驟減少殘餘(yu) 汙染。使用抗氣霧劑移液管的阻止氣霧劑進入eppendorf管內(nei) 。為(wei) PCR樣品配製和擴增後分析設計隔離的區域，在準備新反應前更換手套。總是使用不含有模板的陰性對照檢測汙染。使用預先混合的反應成分，而不是每個(ge) 反應的每個(ge) 試劑單獨加入。一種防止殘餘(yu) 汙染的方法是使用尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）。這種酶（也稱為(wei) 尿嘧啶-N-糖基化酶或UNG）移除DNA中的尿嘧啶。在擴增過程中將脫氧尿嘧啶替換為(wei) 胸腺嘧啶使得可以把前麵的擴增產(chan) 物同模板DNA區分開來。因為(wei) 前麵的擴增產(chan) 物對UDG敏感，所有可以在PCR前對新配製的反應用UDG處理以破壞殘餘(yu) 產(chan) 物。PCR產(chan) 物純化殘餘(yu) 反應成分包括抑製克隆，測序和標記反應的引物，核苷和熱穩定聚合酶。因此，一般在進一步操作之前需要純化PCR產(chan) 物。包括多次酚：氯仿抽提及隨後的PEG沉澱或異丙醇沉澱的純化步驟雖然有效，但是耗費時間，且會(hui) 丟(diu) 失產(chan) 物。Maligen Rapid PCR Purification System在10分鍾內(nei) 從(cong) 反應成分中純化PCR產(chan) 物。它對80bp到10kb很大範圍的PCR片段都有效，有效回收95％的原有樣品（圖26）。擴增後PCR片段的純化使用1.2μg引物（泳道1）或3.5μg引物（泳道2）。峰值包含約1μg擴增產(chan) 物的完整PCR體(ti) 係。引物36到40堿基長。將峰值反應純化，對純化前（泳道A）和純化後（泳道B）的洗脫液水相使用瓊脂糖凝膠電泳分析。部分PCR產(chan) 物可能需要通過凝膠電泳，和影響克隆和測序的非特異性PCR產(chan) 物分離純化出來。使用Maligen Gel Extraction System將目的產(chan) 物從(cong) 瓊脂糖中純化出來，這是一種基於(yu) 矽土的，從(cong) 凝膠中快速純化DNA片段的技術。