問題

可能原因

解決(jue) 方法

無顏色

試劑孵育的時間沒有按說明書(shu) 操作。

確定生物素化抗體(ti) ，聯接的hrp試劑或鏈黴親(qin) 和素-hrp使用的時間是否適當。

不同試劑盒或不同批號的試劑混用。

重新檢查試劑的標簽，確保所有組分都屬於(yu) 正使用的試劑盒。不能混用不同試劑盒或不同批號的試劑。

漏加酶

檢查操作流程，注意不要漏加

hrp酶汙染了疊氮鈉

使用新配製的試劑，禁含疊氮鈉

標準品有問題（若在標本孔中有信號）

按說明書(shu) 檢查標準品的配製過程

使用1瓶新標準品

某一容器未洗淨,殘留滅活酶物質

盡可能用試劑盒內(nei) 容器,另覓一定要潔淨、可靠

使用含血清的緩衝(chong) 液配製/複溶抗體(ti)

重新確認所選用的試劑

.漏加顯色劑a或b

加顯色劑後觀察孔中液麵高度

試劑配製/使用有誤

將實驗重做；嚴(yan) 格按說明書(shu) 操作，每次配製和使用前看清標簽。

緩衝(chong) 液汙染

配製新鮮的緩衝(chong) 液

顯色弱

超過有效期的產(chan) 品可能會(hui) 產(chan) 生很弱的信號。

檢查產(chan) 品的有效期

加入試劑的體(ti) 積和時間有誤

確定所使用的每一個(ge) 試劑的體(ti) 積正確和加入時間是適當。

試劑、樣品用前未能平衡

用前試劑、樣品置室溫平衡10分鍾左右

縮短孵育時間能使實驗的信號變弱。

檢查孵育的時間。

在溫度變化的環境內(nei) 孵育酶標板。

確定孵育的溫度，應避免溫度的變化。

使用了被汙染的試劑

檢查試劑是否被汙染。

標準品/標本製備方法不規範

檢查標準品/標本的製備，標準品應按說明書(shu) 進行複溶和稀釋。低溫貯存的標本避免反複凍融，嚴(yan) 禁使用溶血標本。樣品用nan3防腐,抑製了酶的反應

顯色底物製備不規範

檢查底物的製備，如體(ti) 積是否正確，混合是否恰當充分。

檢測時間不當

是否在規定的時間內(nei) 檢測。

儀(yi) 器設定不正確，濾光片不匹配。

儀(yi) 器是否設定正確，濾光片的選擇是否相符等。

高背景（本底）

洗滌操作不規範

洗板不充分，使用手工洗板常出現。使用洗板機，或使用洗瓶洗滌。每孔應*充滿洗滌緩衝(chong) 液，傾(qing) 出時應迅速。若使用洗板機，應校準並設定足夠充滿每孔的體(ti) 積量。板的內(nei) 側(ce) 不應接觸設備。

檢查每孔是否有殘留的洗液或每孔加樣量的體(ti) 積是否準確。在兩(liang) 次洗板之間加30秒的浸泡。

實驗中孵育溫度和時間不適當

確定每一實驗步驟的孵育溫度和時間是否適當

酶加量過多

加酶前驗看移液器調節量是否準確。

檢查稀釋度，必要時需做效價(jia) 測定試驗。

封閉不*

檢查封閉液的計算量；延長封閉時間。

標本或標準品中的幹擾物質

做適當的對照

顯色劑受光照時間較長,或汙染

顯色劑a和b應於(yu) 使用前10分鍾從(cong) 冰箱取出

整批樣品放置時間過長,樣品汙染

樣品應保持新鮮,或低溫保存,防止汙染

緩衝(chong) 液汙染

製備新鮮的緩衝(chong) 液

吸頭重複使用,未洗淨或消毒不*而用於(yu) 加酶或顯色劑

吸頭盡可能一次性使用

太多的信號：

全部的板子變成規則的藍色

不充分的洗滌/洗滌步驟被遺漏-沒結合的過氧化物酶仍有殘留。

使用洗板機充分洗滌

檢查孔內(nei) 是否有殘留的洗液或加樣量是否準確。

底物溶液混合太早並轉成藍色

應控製底物混合的時機並立即使用

太多的酶結合物

檢查稀釋度，必要時進行效價(jia) 測定

封板膜或試劑容器被重複使用，導致hrp殘留，使tmb底物產(chan) 生非特異藍色。

使用新的封板膜，每步使用不同的試劑容器

緩衝(chong) 液中汙染金屬或hrp

製備新鮮緩衝(chong) 液

高cv值（cv：coefficient of variation），花板

操作不慎或洗滌不充分

按說明書(shu) 洗板、加樣、顯色。洗板尤為(wei) 重要，如上所述

出現幹板，沒有使用封板膜、封板膜重複使用

確定每兩(liang) 步驟間，酶標板應保持濕潤。

使用封板膜封口，注意每步使用新的封板膜。

由於(yu) 操作失誤或板子質量差（結合不均勻）造成包板不均勻。

稀釋用的pbs中不要加其它蛋白

檢查包被和封閉液體(ti) 積、時間和試劑加入的方法。

檢查所使用的酶標板，使用elisa板（不要使用組織培養(yang) 板）

移液器不準確，吸頭重複使用。

檢查並校準移液器。每次取樣必須換吸頭。回顧標本的加入步驟，確保每次加樣的準確性，保證吸取的液體(ti) 按所設定的體(ti) 積吸入和排出，連續加樣時注意檢查吸頭，確保所加液體(ti) 的體(ti) 積。

樣品離心處理不全,反應孔內(nei) 發生凝血或殘留細胞成分

標本充分離心, 3000rpm 6分鍾以上，嚴(yan) 禁使用凝血（溶血）的標本

緩衝(chong) 液汙染

製備新鮮的緩衝(chong) 液

標準曲線可得到，但兩(liang) 點之間區別很差（低或平的曲線）

酶結合物不足

檢查稀釋度，必要時進行效價(jia) 測定

捕獲抗體(ti) 沒有很好結合到板上

檢查所使用的酶標板，使用elisa板（不要使用組織培養(yang) 板）

稀釋用的pbs中不要加其它蛋白

檢測抗體(ti) 不足

檢查稀釋度，必要時進行效價(jia) 測定

板子顯色不足

延長底物孵育實驗

使用推薦品牌的底物溶液

操作不慎

回顧elisa操作流程，消除任何擅自修改的程序。

標準曲線稀釋度計算有誤

核查計算的情況，製備新的標準曲線

標準曲線很好，但是沒有任何期望的陽性信號產(chan) 生

在標本中無相應的細胞因子

使用內(nei) 參對照

重複實驗，重新考慮實驗的相應參數

標本基質遮蓋檢測

將標本至少做1∶2相應的稀釋，或進行係列稀釋觀測它的恢複性

標準曲線很好，但是標本的判讀值很高

標本中含的細胞因子水平超過檢測範圍

將標本做稀釋並再次實驗

當使用hrp酶結合物時，tmb底物加終止液後顯綠色

孔中的試劑顯色不充分

輕輕振蕩板子

邊緣效應

工作環境溫度不均衡

避免將酶標板在變化溫度環境中孵育

漂移

實驗過程中出現間斷

整個(ge) 實驗應連續操作：在實驗開始前將所有標準品和標本做適當的準備

試劑沒有按說明書(shu) 平衡至室溫

在所有試劑加入孔前，確保它們(men) 已平衡至室溫，除非說明書(shu) 中有另外的要求。

 是否可更改試劑盒 所提供的實驗操

作步驟？

一般廠商為(wei) 確保zui高的靈敏度和特異性，對試劑盒都進行了優(you) 化，為(wei) 確保每一試劑盒實驗的規範性應按說明書(shu) 操作。

是否可混用不同試劑盒中的試劑？

不允許。絕大多數試劑在每批試劑盒中是特異的，若有問題可與(yu) 廠家或代理商。

是否可增加或減少標本的體(ti) 積。

商品化的試劑盒所需加入的標本體(ti) 積是優(you) 化的，應按說明書(shu) 操作，不建議更改所加標本的體(ti) 積。

是否可重確定自己的標準曲線的點？

可以。說明書(shu) 上有建議的製備標準曲線時標準品的稀釋度，可改變稀釋倍數和增加曲線的點，但是必須在檢測範圍內(nei) ，高於(yu) 試劑盒中zui高標準品的點和低於(yu) 靈敏度以下的點是無效的。