酶免疫技術是利用酶催化底物反應的生物放大作用，提高特異性抗原-抗體(ti) 免疫學反應檢測敏感性的一種標記免疫技術。該技術所用的酶要求純度高、催化反應的轉化率高、專(zhuan) 一性強、性質穩定、來源豐(feng) 富、價(jia) 格不貴、製備成的酶標抗體(ti) 或抗原性質穩定，繼續保留著它的活性部分和催化能力。在受檢標本中不存在與(yu) 標記酶相同的酶。另外它的相應底物應易於(yu) 製備和保存，價(jia) 格低廉，有色產(chan) 物易於(yu) 測定，光吸收高。

　　一、酶和酶作用的底物

　　1.辣根過氧化酶（HRP）：HRP在蔬菜作物辣根中含量很高，純化方法也不複雜。它是一種糖蛋白，含糖量約18%；分子量為(wei) 44kD；是一種複合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞(ya) 鐵血紅素）結合而成的一種卟啉蛋白質。主酶為(wei) 無色糖蛋白，在275nm波長處有zui高吸收峰；輔基是深棕色的含鐵卟啉環，

　　在403nm波長處有zui高吸收峰。HRP對受氫體(ti) 的專(zhuan) 一性很高，除H202外，僅(jin) 作用於(yu) 小分子醇的過氧化物和尿素的過氧化物。後者為(wei) 固體(ti) ，作為(wei) 試劑較H202方便。

　　許多化合物可作為(wei) HRP的供氧體(ti) ，在ELISA中常用的供氫體(ti) 底物為(wei) 鄰苯二胺（OPD）、四甲基聯苯胺（TMB）和ABTS.OPD為(wei) 在ELISA中應用zui多的底物，靈敏度高，比色方便。其缺點是配成應用液後穩定性差，而且具有致異變性。TMB無此缺點。TMB經酶作用後由無色變藍色，目測對比鮮明；加酸停止酶反應後變黃色，可在比色計中定量；因此應用日見增多。ABTS，雖然靈敏度不如0PD和TMB，但空白值很低。

　　2.堿性磷酸酶（AP）：是從(cong) 牛腸粘膜或大腸杆菌中提取。從(cong) 大腸杆菌提取的AP分子量為(wei) 80kD，酶作用的zui適pH為(wei) 8.0；用小牛腸黏膜提取的AP分子量為(wei) l00kD，zui適pH為(wei) 9.6.一般采用對硝基苯磷酸酯（p-NPP）作為(wei) 底物。它可製成片狀試劑，使用方便。產(chan) 物為(wei) 黃色的對硝基酚，在405nm有吸收峰。用NaOH終止酶反應後，黃色可穩定一段時間。

　　在ELISA中應用AP係統，其敏感性一般高於(yu) 應用HRP係統，空白值也較低。但由於(yu) AP較難得到高純度製劑，穩定性較HRP低，價(jia) 格較HRP高，製備酶結合物時得率較HRP低等原因，國內(nei) 在ELISA中一般均采用HRP.3.其他的酶：有葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和脲酶等。β-半乳糖苷酸的底物常用4-甲基傘(san) 基-β-半乳糖苷，經酶水解後產(chan) 生熒光物質4-甲基傘(san) 酮，可用熒光計檢測。熒光的放大作用大大提高了方法的敏感度。AP也可應用可產(chan) 生熒光的傘(san) 基磷酸酯作底物。其缺點是需要熒光計測定，而且如用固相載體(ti) 直接作為(wei) 測定容器，此載體(ti) 不可發出熒光。脲酶的特點是酶作用後反應液發生pH改變，可使指示劑變色；另外，在人體(ti) 內(nei) 沒有內(nei) 源酶。

　　二、酶標記抗體(ti) 或抗原

　　酶標記的抗原或抗體(ti) 稱為(wei) 結合物（conjugate）。抗原由於(yu) 化學結構不同，可用不同的方法與(yu) 酶結合，如為(wei) 蛋白質抗原，基本上可參考抗體(ti) 酶標記的方法。製備抗體(ti) 酶結合物的方法通常有以下幾種。醫 學教育網原創

　　1.戊二醛交聯法：戊二醛是一種雙功能團試劑，可以使酶與(yu) 蛋白質或其他抗原的氨基通過它而偶聯。戊二醛交聯可用一步法（如連接AP），也可用二步法（如連接HRP）。戊二醛一步法操作簡便、有效，而且重複性好。缺點是交聯時分子間的比例不嚴(yan) 格，大小也不一，影響效果。製備HRP抗體(ti) 結合物也可用二步法，即先將HRP與(yu) 戊二醛作用，透析除去戊二醛，在pH9.5緩衝(chong) 液中再與(yu) 抗體(ti) 作用而形成酶標抗體(ti) 。此法的效率可高於(yu) 一步法l0倍左右。

　　2.過碘酸鹽氧化法：本法隻用於(yu) HRP的交聯。該酶含18%碳水化合物，過碘酸鹽將其分子表麵的多糖氧化為(wei) 醛基。用硼氫化鈉（NaBH4）中和多餘(yu) 的過碘酸。酶上的醛根很活潑，可與(yu) 蛋白質結合，形成按摩爾比例結合的酶標結合物。有人認為(wei) 此法為(wei) 辣根過氧化物酶交聯zui有效的方法。但也有隻認為(wei) 由於(yu) 所用試劑較為(wei) 劇烈，各批實驗結果不易重複。

　　按以上方法製備的結合物一般混有未結合的酶和抗體(ti) 。理論上結合物中混有遊離酶不影響ELISA中zui後的酶活性測定，因經過洗滌，非特異性吸附於(yu) 固相上的遊離酶已被洗去。但遊離的抗體(ti) 則會(hui) 與(yu) 酶標抗體(ti) 競爭(zheng) 相應的固相抗原，因而減低結合到固相上的酶標抗體(ti) 量。因此製備的結合物應予以純化。純化的方法較多，分離大分子混合物的方法均可應用。硫酸銨鹽析法操作簡便，但效果不如用sephadexg-200凝膠過濾的好。

　　3.標記抗體(ti) 鑒定：通常采用棋盤滴定法進行篩選，見第十九章。

　　三、固相載體(ti)

　　酶免疫技術的主要試劑為(wei) 固相的抗原或抗體(ti) 、酶標記的抗原或抗體(ti) 和與(yu) 標記酶直接關(guan) 聯的酶反應底物。可作固相載體(ti) 的物質很多，zui常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質的性能，抗體(ti) 或蛋白質抗原吸附其上後保留原來的免疫活性。聚苯乙烯為(wei) 塑料，可製成各種形式，在測定過程中，它作為(wei) 載體(ti) 和容器，不參與(yu) 化學反應，加之它的價(jia) 格低廉，所以被普遍采用。

　　聚苯乙烯載體(ti) 的形狀主要有三種：小試管、小珠和微量反應板。小試管的特點是還能兼作反應的容器，zui後放入分光光度計中比色。小珠一般為(wei) 直徑0.6cm的圓球，表麵經磨砂處理後吸附麵積大增加。如用特殊的洗滌器，在洗滌過程中使圓珠滾動淋洗，效果更好。zui常用的載體(ti) 為(wei) 微量反應板，於(yu) ELISA測定的產(chan) 品也稱為(wei) ELISA板，通用的標準板形是8×12的96孔式。為(wei) 便於(yu) 作少量標本的檢測，有製成8聯或l2聯孔條的，放入座架後，大小與(yu) 標準ELISA板相同。ELISA板的特點是可以同時進行大量標本的檢測，並可在特定的比色計上迅速讀出結果。現在已有多種自動化儀(yi) 器用於(yu) 微量反應板型的ELISA檢測，包括加樣、洗滌、保溫、比色等步驟，對操作的標準化極為(wei) 有利。

　　良好的ELISA板應該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間和同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由於(yu) 配料的不同和製作工藝的差別，各種產(chan) 品的質量差異很大。因此每一批號的聚苯乙烯製品在使用前須檢查其性能。常用的檢查方法為(wei) ：以一定濃度的人IgG（一般為(wei) 10ng／ml）包被ELISA板各孔後，每孔內(nei) 加入適當稀釋的酶標抗人IgG抗體(ti) ，保溫後洗滌，加底物顯色，終止酶反應後分別測每孔溶液的吸光度。控製反應條件，使各讀數在0.8左右。計算所有讀數的平均值。所有單個(ge) 讀數與(yu) 平均讀數之差應小於(yu) 10%.與(yu) 聚苯乙烯類似的塑料為(wei) 聚氯乙烯。作為(wei) ELISA固相載體(ti) ，聚氯乙烯板的特點為(wei) 質軟板薄，可切割，價(jia) 廉、但光潔度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯對蛋白質的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值有時也略高。

　　為(wei) 比較不同固相在某一ELISA測定中的優(you) 劣，可用以下方法加以檢驗：用其他免疫學測定方法選出一個(ge) 典型的陽性標本和一個(ge) 典型的陰性標本。將它們(men) 分別進行一係列稀釋後，在不同的固相載體(ti) 上按預定的ELISA操作步驟進行測定，然後比較測定結果。在哪一種載體(ti) 上陽性結果與(yu) 陰性結果判別zui大，這種載體(ti) 就是這一ELISA測定的zui合適的固相載體(ti) 。

　　除塑料製品外，固相酶免疫測定的載體(ti) 還有兩(liang) 種材料：一是微孔濾膜，如硝酸纖維素膜、尼龍膜等，這類測定形式將在本章“膜載體(ti) 的酶免疫測定”中介紹。另一種載體(ti) 是以含鐵的磁性微粒製作的，反應時固相微粒懸浮在溶液中，具有液相反應的速率，反應結束後用磁鐵吸引作為(wei) 分離的手段，洗滌也十分方便，但需配備特殊的儀(yi) 器。

　　四、免疫吸附劑

　　固相的抗原或抗體(ti) 稱為(wei) 免疫吸附劑。將抗原或抗體(ti) 固相化的過程稱為(wei) 包被。由於(yu) 載體(ti) 的不同，包被的方法也不同。如以聚苯乙烯ELISA板為(wei) 載體(ti) ，通常將抗原或抗體(ti) 溶於(yu) 緩衝(chong) 液（zui常用的為(wei) pH9.6的碳酸緩衝(chong) 液）中，加於(yu) ELISA板孔中在4℃過夜，經清洗後即可應用。如果包被液中的蛋白質濃度過低，固相載體(ti) 表麵有能被此蛋白質*覆蓋，其後加入的血清標本和酶結合物中的蛋白質也會(hui) 部分地吸附於(yu) 固相載體(ti) 表麵，zui後產(chan) 生非特異性顯色而導致本底偏高。在這種情況下，如在包被後再用1%～5%牛血清白蛋白包被一次，可以消除這種幹擾。這一過程稱為(wei) 封閉（blocking）。包被好的ELISA板在低溫可放置一段時間而不失去其免疫活性。