一.  直接免疫熒光法測抗原 

基本原理 

        將熒光素標記在相應的抗體(ti) 上，直接與(yu) 相應抗原反應。其優(you) 點是方法簡便、特異性高，非特異性熒光染色少，相對使用標記抗體(ti) 用量偏大。 

試劑與(yu) 儀(yi) 器 

          磷酸鹽緩衝(chong) 鹽水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4 

          熒光標記的抗體(ti) 溶液：以 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 進行稀釋 

          緩衝(chong) 甘油：分析純無熒光的甘油 9 份+ pH9.2 0.2M 碳酸鹽緩衝(chong) 液 1 份配製 

          搪瓷桶三隻（內(nei) 有 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 1500ml） 

          有蓋搪瓷盒一隻（內(nei) 鋪一層浸濕的紗布墊） 

          熒光顯微鏡 

          玻片架 

          濾紙 

          37℃溫箱等。 

實驗步驟 

1.  滴加 0.01mol/L，pH7.4 的PBS於(yu) 待檢標本片上，10min後棄去，使標本保持一定濕度。 

2.  滴加適當稀釋的熒光標記的抗體(ti) 溶液，使其*覆蓋標本，置於(yu) 有蓋搪瓷盒內(nei) ，保溫一

30min  

定時間（參考：30min）。 

3.  取出玻片，置玻片架上，先用 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 衝(chong) 洗後，再按順序過 0.01mol/L，

pH7.4 的 PBS 三缸浸泡，每缸 3-5 min，不時振蕩。 

4.  取出玻片，用濾紙吸去多餘(yu) 水分，但不使標本幹燥，加一滴緩衝(chong) 甘油，以蓋玻片覆蓋。 

5.  立即用熒光顯微鏡觀察。觀察標本的特異性熒光強度，一般可用“+”表示： 

（-）無熒光；（±）極弱的可疑熒光；（+）熒光較弱，但清楚可見；（++）熒光明亮；（+++ 

--++++）熒光閃亮。待檢標本特異性熒光染色強度達“++”以上，而各種對照顯示為(wei) （±）

或（-），即可判定為(wei) 陽性。

注意事項

1.  對熒光標記的抗體(ti) 的稀釋，要保證抗體(ti) 的蛋白有一定的濃度，一般稀釋在 1：20-100 之

間，要自行摸索*梯度，建立的稀釋比例，抗體(ti) 濃度過低，會(hui) 導致產(chan) 生的熒光過弱，

影響結果的觀察。 

2.  染色的溫度和時間需要根據各種不同的標本及抗原而變化，染色時間可以從(cong)  10 min 到數

小時，一般 30 min 已足夠。染色溫度多采用室溫（25℃左右），高於(yu)  37℃可加強染色效果，

但對不耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用 0-2℃的低溫，延長染色時間。低溫染

色過夜較 37℃30 min 效果好的多。 

3.  為(wei) 了保證熒光染色的正確性，試驗時需設置下述對照，以排除某些非特異性熒光染

色的幹擾。 

（1）標本自發熒光對照：標本加 1-2 滴 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS。 

（2）特異性對照（抑製試驗）：標本加未標記的特異性抗體(ti) ，再加熒光標記的特異性抗

體(ti) 。 

    如果標本自發熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光，  待檢標本呈強熒光，則為(wei) 特異性陽性染色。 

4.  一般標本在高壓汞燈下照射超過 3min，就有熒光減弱現象，經熒光染色的標本在當天觀察，隨著時間的延長，熒光強度會(hui) 逐漸下降。

二.    間接免疫熒光法測抗原 

基本原理 

染色程序分為(wei) 兩(liang) 步，*步，用已知未標記的抗體(ti) （待檢標本）加到已知抗原（待檢標本）

標本上，在濕盒中 37℃保溫 30min，使抗原抗體(ti) 充分結合，然後洗滌，除去未結合的抗體(ti) 。

第二步，加上熒光標記的抗球蛋白抗體(ti) 或抗 IgG、IgM 抗體(ti) （通常為(wei) 熒光標記的對應二抗）。

如果*步發生了抗原抗體(ti) 反應，標記的熒光標記的二抗就會(hui) 和已結合抗原的抗體(ti) 進一步結

合，從(cong) 而可鑒定被檢測抗原。 

試劑與(yu) 儀(yi) 器 

          磷酸鹽緩衝(chong) 鹽水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4 

          緩衝(chong) 甘油：分析純無熒光的甘油 9 份+ pH9.2 0.2M 碳酸鹽緩衝(chong) 液 1 份配製。

          熒光標記的抗人球蛋白抗體(ti) ：以 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 進行稀釋  。 

          搪瓷桶三隻（內(nei) 有 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 1500ml） 

          有蓋搪瓷盒一隻（內(nei) 鋪一層浸濕的紗布墊） 

          熒光顯微鏡 

          玻片架 

          濾紙 

          37℃溫箱等。 

實驗步驟 

1.  滴加 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 於(yu) 未知抗原標本片，10min 後棄去，使標本片保持一定濕度。 

2.  滴加以 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 適當稀釋抗體(ti) ，覆蓋未知抗原標本片。將玻片置於(yu) 有蓋搪瓷盒內(nei) ，37℃保溫 30min。 

3.  取出玻片，置於(yu) 玻片架上，先用 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 衝(chong) 洗 1-2 次，然後按順序過0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 三缸浸泡，每缸 5min，不時振蕩  。 

4.  取出玻片，用濾紙吸去多餘(yu) 水分，但不使標本幹燥，滴加一滴一定稀釋度的熒光標記二

抗 

5.  將玻片平放在有蓋搪瓷盒內(nei) ，37℃保溫 30min。 

6.  重複操作 3。 

7.  取出玻片，用濾紙吸去多餘(yu) 水分，滴加一滴緩衝(chong) 甘油，再覆以蓋玻片。

8.  熒光顯微鏡高倍視野下觀察，結果判定同直接法。 

注意事項 

1.  熒光染色後一般在 1h 內(nei) 完成觀察，或於(yu)  4℃保存 4h，時間過長  ，會(hui) 使熒光減弱。 

2.  每次試驗時  ，需設置以下兩(liang) 種對照： 

（1） 陰性對照：陰性血清+熒光標記物   （需有使用人員自行建立標準） 

（2） 熒光標記物對照：PBS+熒光標記物 

如果標本自發熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光，  待檢標本呈強熒光，則為(wei)

特異性陽性染色。  

3.  未知抗原標本片需在操作的各個(ge) 步驟中，始終保持濕潤，避免幹燥。 

4.  所滴加的抗體(ti) 或熒光標記物，應始終保持在未知抗原標本片上，避免因放置不平使液體(ti)

流失，從(cong) 而造成非特異性熒光染色。 

Storage:  Store at –20 ºC for one year. Avoid repeated freeze/thaw cycles. The 

lyophilized antibody is stable at room temperature for at least one month and for greater 

than a year when kept at -20ºC. When reconstituted in sterile pH 7.4 0.01M PBS or diluent 

of antibody, the antibody is stable for at least six weeks at 2-4 ºC. 

Important Note:  This product as supplied is intended for research use only, not for use in 

human, therapeutic or diagnostic applications.