雙抗體(ti) 夾心法是檢測抗原zui常用的方法，操作步驟如下：  
1） 將特異性抗體(ti) 與(yu) 固相載體(ti) 聯結，形成固相抗體(ti) 。洗滌除去未結合的抗體(ti) 及雜質。  
2） 加受檢標本，保溫反應。標本中的抗原與(yu) 固相抗體(ti) 結合，形成固相抗原抗體(ti) 複合物。洗滌除去其他未結合物質。  
3） 加酶標抗體(ti) ，保溫反應。固相免疫複合物上的抗原與(yu) 酶標抗體(ti) 結合。*洗滌未結合的酶標抗體(ti) 。此時固相載體(ti) 上帶有的酶量與(yu) 標本中受檢抗原的量相關(guan) 。  
4） 加底物顯色。固相上的酶催化底物成為(wei) 有色產(chan) 物。通過比色，測知標本中抗原的量。在臨(lin) 床檢驗中，此法適用於(yu) 檢驗各種蛋白質等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。隻要獲得針對受檢抗原的異性抗體(ti) ，就可用於(yu) 包被固相載體(ti) 和製備酶結合物而建立此法。如抗體(ti) 的來源為(wei) 抗血清，包被和酶標用的抗體(ti) 分別取自不同種屬的動物。如應用單克隆抗體(ti) ，一般選擇兩(liang) 個(ge) 針對抗原上不同決(jue) 定簇的單抗，分別用於(yu) 包被固相載體(ti) 和製備酶結合物。這種雙位點夾心法具有很高的特異性，而且可以將受檢標本和酶標抗體(ti) 一起保溫反應，作一步檢測。  
在一步法測定中，當標本中受檢抗原的含量很高時，過量抗原分別和固相抗體(ti) 及酶標抗體(ti) 結合，而不再形成"夾心複合物"。類同於(yu) 沉澱反應中抗原過剩的後帶現象，此時反應後顯色的吸光值（位於(yu) 抗原過剩帶上）與(yu) 標準曲線（位於(yu) 抗體(ti) 過剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同（參見1.3.2，圖1-4），如按常法測讀，所得結果將低於(yu) 實際的含量，這種現象被稱為(wei) 鉤狀效應（hook effect），因為(wei) 標準曲線到達高峰後呈鉤狀彎落。鉤狀效應嚴(yan) 重時，反應甚至可不顯色而出現假陰性結果。因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常增高的物質（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時，應注意可測範圍的zui高值。用高親(qin) 和力的單克隆抗體(ti) 製備此類試劑可削弱鉤狀效應。  
假使在被測分子的不同位點上含有多個(ge) 相同的決(jue) 定簇，例如HBsAg的a決(jue) 定簇，也可用針對此決(jue) 定的同一單抗分別包被固相和製備酶結合物。但在HBsAg的檢測中應注意亞(ya) 型問題，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4個(ge) 亞(ya) 型，雖然每種亞(ya) 型均有相同的a決(jue) 定簇的反應性，這也是用單抗作夾心法應注意的問題。  
雙抗體(ti) 夾心法測抗原的另一注意點是類風濕因子（RF）的幹擾。RF是一種自身抗體(ti) ，多為(wei) IgM型，能和多種動物IgG的Fc段結合。用作雙抗體(ti) 夾心法檢測的血清標本中如含有RF，它可充當抗原成份，同時與(yu) 固相抗體(ti) 和酶標抗體(ti) 結合，表現出假陽性反應。采用F（ab'）或Fab片段作酶結合物的試劑，由於(yu) 去除了Fc段，從(cong) 而消除RF的幹擾。雙抗體(ti) 夾心法ELISA試劑是否受RF的影響，已被列為(wei) 這類試劑的一項考核指標（參見6.2）。  
雙抗體(ti) 夾心法適用於(yu) 測定二價(jia) 或二價(jia) 以上的大分子抗原，但不適用於(yu) 測定半抗原及小分子單價(jia) 抗原，因其不能形成兩(liang) 位點夾心。  

2. 雙抗原夾心法測抗體(ti)   
反應模式與(yu) 雙抗體(ti) 夾心法類似。用特異性抗原進行包被和製備酶結合物，以檢測相應的抗體(ti) 。與(yu) 間接法測抗體(ti) 的不同之處為(wei) 以酶標抗原代替酶標抗抗體(ti) 。此法中受檢標本不需稀釋，可直接用於(yu) 測定，因此其敏感度相對高於(yu) 間接法。乙肝標誌物中抗HBs的檢測常采用本法。本法關(guan) 鍵在於(yu) 酶標抗原的製備，應根據抗原結構的不同，尋找合適的標記方法。