臨(lin) 床檢驗中一般采用商品盒進行測定。ELISA中有三個(ge) 必要
的：免疫吸附劑、結合物和酶的底物。
完整的ELISA盒包含以下各組分：
（1）已包被抗原或的固相載體(ti) （免疫吸附劑）；
（2）酶標記的抗原或（結合物）；
（3）酶的底物；
（4）陰性對照品和陽性對照品（定性測定中），參考標準品和控製血清（定量測定中）；
（5）結合物及標本的稀釋液；
（6）洗滌液；
（7）酶反應終止液。
3.1　免疫吸附劑
已包被抗原或的固相載體(ti) 在低溫（2~8℃）幹燥的條件下一般可保存6個(ge) 月。有些不完整的試盒，僅(jin) 供應包被用抗原或抗體(ti) ，檢測人員需自行包被。以下簡述固相載體(ti) 和包被過程。
3.1.1　固相載體(ti)
固相載體(ti) 在ELISA測定過程中作為(wei) 吸附劑和容器，不參與(yu) 化學反應。可作ELISA中載體(ti) 的材料很多，zui常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質的性能，抗體(ti) 或蛋白質抗原吸附其上後仍保留原來的免疫學活性，加之它的價(jia) 格低廉，所以被普遍采用。聚苯乙烯為(wei) 塑料，可製成各種形式。
ELISA載體(ti) 的形狀主要有三種：微量滴定板、小珠和小試管。以微量滴定板zui為(wei) 常用，於(yu) EILSA的產(chan) 品稱為(wei) ELISA板，上標準的微量滴定板為(wei) 8×12的96孔式。為(wei) 便於(yu) 作少量標本的檢測，有製成8聯孔條或12聯孔條的，放入座架後，大小與(yu) 標準ELISA板相同。ELISA板的特點是可以同時進行大量標本的檢測，並可在特製的比色計上迅速讀出結果。現在已有多種自動化儀(yi) 器用於(yu) 微量滴定板型的ELISA檢測，包括加樣、洗滌、保溫、比色等步驟，對操作的標準化極為(wei) 有利。聚苯乙烯經射線照射後，其吸附性能特別是對免疫球蛋白的吸附性能增加，應用於(yu) 雙抗體(ti) 夾心法可使固相上抗體(ti) 量增多，但用於(yu) 間接法測抗體(ti) 時空白值較大。
良好的ELISA板應該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由於(yu) 原料的不同和製作工藝的差別，各種產(chan) 品的質量差異很大，因此，每一批號的ELISA板在使用前須事先檢查其性能。常用的檢查方法為(wei) ：以一定濃度的人IgG（一般為(wei) 10ng/ml）包被ELISA板各孔，洗滌後每孔內(nei) 加入適當稀釋度的酶標抗人IgG抗體(ti) ，保溫後洗滌，加底物顯色，終止酶反應後，分別測每孔溶液的吸光度。控製反應條件，使各孔讀數在吸光度0.8左右。計算全部讀數的平均值。所有單個(ge) 讀數與(yu) 全部讀數的均數之差，應小於(yu) 10%。
與(yu) 聚苯乙烯類似的塑料是聚氯乙烯。作為(wei) ELISA固相載體(ti) ，聚氯乙烯的特點為(wei) 質軟板薄，可剪割，價(jia) 廉，但光潔度不如聚苯乙烯板，孔底亦不如聚苯乙烯平整。聚氯乙烯對蛋白質的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。
為(wei) 比較不同固相在某一ELISA測定中的優(you) 劣，可應用如下的試驗：用其他免疫學測定方法選出一個(ge) 典型的陽性標本和陰性標本，將它們(men) 進行一係列稀釋後，在不同的固相載體(ti) 上按預定的ELISA操作步驟進行測定，然後比較結果。在哪一種載體(ti) 上陽性結果與(yu) 陰性結果差別zui大，這種載體(ti) 就是這一ELISA測定項目的zui合適的固相載體(ti) 。
在ELISA中，用作固相載體(ti) 的小珠一般為(wei) 直徑0.6cm的圓珠，表麵經磨砂處理後吸附麵積大大增加。ELISA板孔的吸附麵積約為(wei) 200mm2，小珠均為(wei) 1000mm2，將近ELISA板孔的5倍。吸附麵積的增大即意味著固相抗原或抗體(ti) 量的增加。再者，球型小珠的表麵弧度更有利於(yu) 吸附的抗原決(jue) 定簇或抗體(ti) 結合位點的暴露麵處於(yu) *反應狀態，因此珠式ELISA的反應往往更為(wei) 靈敏。小珠的另一特點是更易於(yu) 使洗滌*，使用特殊的洗滌器，使小珠在洗滌過程中滾動淋洗，其洗滌效果遠較板孔的浸泡式為(wei) 好。但由於(yu) 磨砂工藝的難度較大，小珠的均一性較差。
小試管作為(wei) 固相載體(ti) 也有較大的吸附表麵，而且標本的反應量也相應增加。板式及珠式ELISA的標本量一般為(wei) 100-200ul，而小試管可根據需要加大反應體(ti) 積，標本反應量的增加有助於(yu) 試驗敏感性的提高。小試管還可以當作比色杯，zui後直接放入分光光度計中比色。
也有應用聚苯乙烯膠乳或其他材料製成的微粒作為(wei) ELISA固相載體(ti) 的。其優(you) 點是表麵積極大，反應在懸液中進行，其速率與(yu) 液相反應近似。以含鐵的磁性微粒作為(wei) ELISA固相載體(ti) ，反應後用磁鐵的吸引進行分離，洗滌方便，盒一般均配以特殊儀(yi) 器。
3.1.2 　包被的方式
將抗原或抗體(ti) 固定在過程稱為(wei) 包被（coating）。換言之，包被即是抗原或抗體(ti) 結合到固相載體(ti) 表麵的過程。蛋白質與(yu) 聚苯乙烯固相載體(ti) 是通過物理吸附結合的，靠的是蛋白質分子結構上的疏水基團與(yu) 固相載體(ti) 表麵的疏水基團間的作用於(yu) 。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質的分子量、等電點、濃度等的影響。載體(ti) 對不同蛋白質的吸附能力是不相同的，大分子蛋白質較小分子蛋白質通常含有更多的疏水基團，故更易吸附到固相載體(ti) 表麵。IgG對聚苯乙烯等固相具有較強的吸附力，其聯結多發生在Fc段上，抗體(ti) 結合點暴露於(yu) 外，因此抗體(ti) 的包被一般均采用直接吸附法。蛋白質抗原大多也可采用與(yu) 抗體(ti) 相似的方法包被。當抗原決(jue) 定簇存在於(yu) 或鄰近於(yu) 疏水區域時，抗原與(yu) 固相載體(ti) 的直接吸附可使抗原決(jue) 定簇不能充分暴露，在這種情況下，直接包被效果不佳，可以采用間接的捕獲包被法，即先將針對該抗原的特異抗體(ti) 作預包被，其後通過抗原抗體(ti) 反應使抗原固相化。此間接結合在固相上的抗原遠離載體(ti) 表麵，其抗原決(jue) 定簇也得以充分暴露。間接包被的抗原經固相抗體(ti) 的親(qin) 和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質較多的抗原也可采用捕獲包被法（見2.2.4），試驗的特異性、敏感性均由此得以改善，重複性亦佳。間接包被的另一優(you) 點是抗原用量少，僅(jin) 為(wei) 直接包被的1/10乃至於(yu) /100。不易吸附在聚苯乙烯載體(ti) 上的非蛋白質抗原可采用特殊的包被方式。例如，在檢測抗DNA抗體(ti) 時，需用DNA作為(wei) 包被抗原，而普遍的固相載體(ti) 一般不能直接與(yu) 核酸結合。可將聚苯乙烯板先經紫外線照射（例如30W紫外燈，75cm照射12小時），以增加其吸附性能。固相載體(ti) 先用堿性蛋白質，如聚賴氨酸、魚精蛋白等作預包被，也可提高核酸的結合力。也可用親(qin) 和素生物素係統作間接包被，即用親(qin) 和素先包被載體(ti) ，然後加入生物素化的DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴大應用於(yu) 各種抗原物質的定量測定。
脂類物質無法與(yu) 固相載體(ti) 結合，可將其在有機溶劑（例如乙醇）中溶解後加入ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風吹幹，待酒精揮發後，讓脂質自然幹固在固相表麵。抗心磷脂抗體(ti) 的ELISA一般采用這種包被方式。

3.1.3 　包被用抗原
用於(yu) 包被固相載體(ti) 的抗原按其來源不同可分為(wei) 天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。天然抗原可取自動物組織、微生物培養(yang) 物等，須經提取純化才能作包被用。如HBsAg可以從(cong) 攜帶者的血清中提取，一般的細菌和病毒抗原可以從(cong) 其培養(yang) 物中提取，蛋白成份抗原可從(cong) 富含此抗原的材料中提取等（例如AFP從(cong) 臍帶血或胎肝中提取）。重組抗原是抗原基因在質粒體(ti) 中表達的蛋白質抗原，多以大腸杆菌或菌為(wei) 質粒體(ti) 。重組抗原的優(you) 點是除工程菌成份外，其他雜質少，而且無傳(chuan) 染性，但純化技術難度較大。以大腸杆菌為(wei) 質粒體(ti) 的重組抗原如不能充分除大腸杆菌成份，用於(yu) ELISA，在反應中可出現假陽性，因不少受檢者受大腸杆菌感染而在血清中存在抗大腸杆菌抗體(ti) 。重組抗原的另一特點是能用基因工程製備某些無法從(cong) 天然材料中分離的抗原物質。例如丙型肝炎病毒（HCV）尚不能培養(yang) 成功，而且丙肝病人血清中HCV抗原含量極微。目前檢測抗HCV ELISA中所用包被抗原大多為(wei) 根據HCV的基因表達而製備的重組抗原。在傳(chuan) 染病診斷中，不少重組抗原如HBsAg、HBeAg和HIV抗原等均在ELISA中取得應用。合成多肽抗原是根據蛋白質抗原分子的某一抗原決(jue) 定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。多肽抗原一般隻含有一個(ge) 抗原決(jue) 定簇，純度高，特異性也高，但由於(yu) 分子量太小，往往難於(yu) 直接吸附於(yu) 固相上。多肽抗原的包被一般需先使其與(yu) 無關(guan) 蛋白質如牛血清白蛋白質（BSA）等偶聯，借助於(yu) 偶聯物與(yu) 固相載體(ti) 的吸附，間接地結合到固相載體(ti) 表麵。應用多肽抗原的另一注意點為(wei) 他僅(jin) 能檢測與(yu) 其相應的抗體(ti) 。一種蛋白質抗原往往含有多個(ge) 不同的能引起抗體(ti) 產(chan) 生的決(jue) 定簇，因此在受檢血清中的其他抗體(ti) 就不能與(yu) 該多肽抗原發生反應。另外，某些微生物發生變異時往往發生抗原結構變化，在這種情況下，用個(ge) 別多肽抗原進行包被可引起其他抗體(ti) 的漏檢。
3.1.4 　包被用抗體(ti)
包被固相載體(ti) 的抗體(ti) 應具有高親(qin) 和力和高特異性，可取材於(yu) 抗血清或含單抗體(ti) 的腹水或培養(yang) 液。如免疫用抗原中含有雜質（即便是極微量的），在抗血清中將出現雜抗體(ti) ，必須除去（可用吸收法）後才能用於(yu) ELISA，以保證試驗的特異性。抗血清不能直接用於(yu) 包被，應先提取IgG，通常采用硫酸銨鹽析和Sephadex凝膠過濾法。一般經硫酸銨鹽析粗提的IgG已可用於(yu) 包被，高度純化的IgG性質不穩定。如需用高親(qin) 和力的抗體(ti) 包被以提高試驗的敏感性，則可采用親(qin) 和層析法以除去抗血清中含量較多的非特異性IgG。腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強，因此不需要作吸收和親(qin) 和層析處理，一般可將腹水作適當稀釋後直接包被，必要時也可用純化的IgG。應用單抗包被時應注意，一種單抗僅(jin) 針對一種抗原決(jue) 定簇，在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得更好的效果。
3.1.5 　包被的條件
　　包被用抗原或抗體(ti) 的濃度，包被的溫度和時間，包被液的pH等應根據試驗的特點和材料的性質而選定。抗體(ti) 和蛋白質抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩衝(chong) 液作為(wei) 稀釋液，也有用pH7.2的磷酸鹽緩衝(chong) 液及pH7~8的Tris-HCL緩衝(chong) 液作為(wei) 稀釋液的。通常在ELISA板孔中加入包被液後，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2小時被認為(wei) 具有同等的包被效果。包被的zui適當濃度隨載體(ti) 和包被物的性質可有很大的變化，每批材料需通過實驗與(yu) 酶結合物的濃度協調選定。一般蛋白質的包被濃度為(wei) 100ng/ml-20ug/ml。
3.1.6 　　封閉
封閉（blocking）是繼包被之後用高濃度的無關(guan) 蛋白質溶液再包被的過程。抗原或抗體(ti) 包被時所用的濃度較低，吸收後固相載體(ti) 表麵尚有未被占據的空隙，封閉就是讓大量不相關(guan) 的蛋白質充填這些空隙，從(cong) 而排斥在ELISA其後的步驟中幹擾物質的再吸附。封閉的手續與(yu) 包被相類似。zui常用的封閉劑是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或1%明膠作為(wei) 封閉劑的。脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑，其zui大的特點是價(jia) 廉，可以高濃度使用（5%）。高質量的速溶食用低脂奶粉即可直接當作封閉劑使用，但由於(yu) 奶粉的成份複雜，而且封閉後的載體(ti) 不易長期保存，因此在盒的製備中較少應用。
封閉是否必要，取決(jue) 於(yu) ELISA的模式及具體(ti) 的實驗條件。並非所有的ELISA固相均需封閉，封閉不當反而會(hui) 使陰性本底增高。一般說來，雙抗體(ti) 夾心法，隻要酶標記物是高活性的，操作時洗滌*，不經封閉也可得到滿意的結果。特別是用單抗腹水直接包被時，因其中大量非抗體(ti) 蛋白在包被時同樣也吸附在固相表麵，業(ye) 已起到了類似封閉劑的作用。但在間接法測定中，封閉一般是不可少的（見2.2.2）。包被好的ELISA板幹燥後放入密封袋或錫袋中，在低溫可保存數月。