SuperRT一步法RT-PCR試劑盒說明書(shu)

SuperRT One Step RT-PCR Kit

目錄號：YJ0742

保存條件：-20℃保存。

組分說明

           Cat. No.                                   YJ0742

           Kit Size                                      100

           SuperRT OneStep RT-PCR EnzymeMix             50 μl

           2×OneStep RT-PCR Buffer                      1.4 ml

           RNase-Free Water                             1 ml

             本產(chan) 品僅(jin) 供科研使用，請勿用於(yu) 臨(lin) 床診斷及其他用途  

產(chan) 品簡介

　　本試劑盒是專(zhuan) 為(wei) 一步法RT-PCR實驗研製，逆轉錄和PCR在同一反應體(ti) 係中進行，

反應過程中無需添加試劑，無需打開管蓋，在避免汙染的同時提高了檢測靈敏度和實驗

效率。本試劑盒包括全新逆轉錄酶、快速熱啟動DNA聚合酶，同時包含適用於(yu) 逆轉

錄和PCR擴增的反應緩衝(chong) 液和實驗中所必需的其它組分。SuperRT逆轉錄酶RNase H活

性缺失，減少了逆轉錄反應中 RNA的降解。該逆轉酶逆轉錄效率高，可對少量 RNA模

板進行良好的逆轉錄反應。 PCR反應使用的快速熱啟動 DNA聚合酶具有擴增效率高、

特異性強、延伸速度快的優(you) 良性能。*的緩衝(chong) 體(ti) 係使逆轉錄酶和聚合酶同時發揮zui大

功效。使用本試劑盒擴增得到的目的產(chan) 物3′端附有一個(ge) ″A″堿基，可直接用於(yu) T/A克隆。

注意事項

1．在操作過程中應避免RNase汙染，防止RNA降解或實驗中的交叉汙染，建議在專(zhuan) 門

   的區域進行RNA操作，使用專(zhuan) 門的儀(yi) 器和耗材，操作人員帶口罩和一次性手套並經

   常更換手套。

2．實驗盡量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，應使用0.1％DEPC（焦碳酸二乙

   酯）水溶液在37℃處理12小時，並在120℃下高壓滅菌30分鍾後使用，或者將玻璃

   器皿在180℃下幹熱滅菌60分鍾後使用。實驗中用到的無菌水應使用 0.1%的DEPC

   處理後進行高壓滅菌。

3．本試劑盒中的所有試劑使用前請上下顛倒輕輕混勻，盡量避免起泡，並經短暫離心

   後使用。所涉及的酶類使用後應盡快放回-20℃，避免反複凍融。

4．本試劑盒必須使用特異性引物，引物的選擇可根據具體(ti) 實驗來選擇，引物設計的好

   壞直接影響到RT-PCR  反應的結果，設計引物時需考慮GC含量，引物長度，引物

   位置，PCR產(chan) 物的二級結構等因素，建議采用專(zhuan) 業(ye) 的引物設計軟件來設計。

使用方法

1．將RNA模板、引物、  OneStep  RT-PCR   Buffer、SuperRT    OneStep   RT-PCR

   EnzymeMix和RNase-Free   Water溶解並置於(yu) 冰上備用。

2．根據以下表格配製反應體(ti) 係：

試劑                                         25 μl反應體(ti) 係         終濃度

      2×One Step RT-PCR Buffer                      12.5 μl          1×

      Forward Primer，10 μM                            1 μl         0.4 μM

      Reverse Primer，10 μM                            1 μl         0.4 μM

      SuperRT OneStep RT-PCR EnzymeMix               0.5 μl

      RNA Template                                   X μl        1 pg – 1 μg

      RNase-Free water                            up to 25 μl

   注意：引物濃度請以終濃度0.1-1.0 μM作為(wei) 設定範圍的參考。擴增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；發生非特異性反應時，可降低引物濃度，由此優(you) 化反應體(ti) 係。

3．渦旋震蕩混勻，短暫離心，將溶液收集到管底。

4．將熱循環儀(yi) 預熱到45℃，將PCR管置於(yu) 熱循環儀(yi) 中，進行RT-PCR反應。

   反應條件：

                  步驟            溫度        時間

                 反轉錄            45℃      30 min

               PCR預變性           95℃       2 min

                  變性            94℃       30 s

                  退火          55-65℃      30 s      30-40個(ge) 循環

                  延伸            72℃       30 s

                 終延伸            72℃       5 min

   注意：1）一般PCR實驗中退火溫度比擴增引物的熔解溫度Tm低5℃，退火時間一般為(wei) 20-30秒，無法得到理想的擴增效率時，適當降低退火溫度；發生非特異性反應時，提高退火溫度，由此優(you) 化反應條件。

   2）延伸時間根據擴增的片段大小設定，本產(chan) 品中包含的DNA Polymerase擴增效率為(wei) 1 kb/30s。

   3）可根據擴增產(chan) 物的下遊應用設定循環數。循環次數太少，擴增量不足；循環次數多，錯配機率會(hui) 增加，非特異性背景嚴(yan) 重。所以，在保證產(chan) 物得率的前提下，應盡量減少循環次數。

5．反應結束後取5 μl反應產(chan) 物，加入適量上樣緩衝(chong) 液後進行電泳檢測結果。

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     相關(guan) 產(chan) 品信息

目錄號                   產(chan) 品名稱                                 產(chan) 品特點

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YJ0581      超純RNA提取試劑盒    兼具有適用範圍廣和純度高特點的RNA提取試劑

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