SuperRT cDNA*鏈合成試劑盒說明書(shu)

SuperRT cDNA Kit

目錄號：YJ0741

保存條件：-20℃保存。

組分說明

           Cat. No.                     YJ0741        YJ0741A

           Kit Size                        25            100

           SuperRT，200 U/μl               25 μl        100 μl

           5×RT Buffer                   120 μl        500 μl

           Primer Mix                     60 μl        240 μl

           dNTP Mix，2.5 mM Each          120 μl        500 μl

           RNase-Free Water               1 ml          1 ml

             本產(chan) 品僅(jin) 供科研使用，請勿用於(yu) 臨(lin) 床診斷及其他用途  

產(chan) 品簡介

　　本產(chan) 品是專(zhuan) 為(wei) 兩(liang) 步法RT-PCR*步實驗配製的cDNA*鏈合成試劑盒。該試劑

盒中使用的逆轉錄酶是一種利用大腸杆菌工程菌進行重組與(yu) 表達的全新逆轉錄酶，

去除了RNase H活性並增強了其熱穩定性，可利用極低量的總RNA或mRNA合成cDNA

*鏈，起始樣本量可低至pg級。SuperRT逆轉錄酶與(yu) RNA親(qin) 合能力強，能通讀GC含

量高，二級結構複雜的RNA模板，獲得高產(chan) 量的cDNA。

　　本產(chan) 品包含從(cong) RNA模板逆轉錄成cDNA*鏈所需的所有試劑，含有Super RT

逆轉錄酶、反應緩衝(chong) 液、引物、dNTP等，使用簡單方便。本係統對後續的PCR以及定

量PCR試驗兼容性高，適用各種PCR反應的DNA聚合酶。

產(chan) 品特點

·逆轉錄：與(yu) RNA模板親(qin) 和力高，逆轉錄效率高達90%，可識別pg級別的模板。

·自由應對複雜模板：即使GC含量高，二級結構複雜的模板，無需高溫變性，也可得

  到良好結果。

·使用方便：試劑盒包含除RNA模板外的逆轉錄所需全部試劑。

注意事項

1．在操作過程中應避免RNase汙染，防止RNA降解或實驗中的交叉汙染，建議在專(zhuan) 門

   的區域進行RNA操作，使用專(zhuan) 門的儀(yi) 器和耗材，操作人員帶口罩和一次性手套並經

   常更換手套。

2．實驗盡量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，應使用0.1％DEPC（焦碳酸二乙

   酯）水溶液在37℃處理12小時，並在120℃下高壓滅菌30分鍾後使用，或者將玻璃

   器皿在180℃下幹熱滅菌60分鍾後使用。實驗中用到的無菌水應使用 0.1%的DEPC

   處理後進行高壓滅菌。

3．本試劑盒中的所有試劑使用前請上下顛倒輕輕混勻，盡量避免起泡，並經短暫離心

   後使用。所涉及的酶類使用後應盡快放回-20℃，避免反複凍融。

4．若起始RNA的量小於(yu) 50  ng，建議加入RNA酶抑製劑（RNasin）。本試劑盒並未提

   供，如需要可單獨向本公司訂購，貨號：YJ0596。

使用方法

注意：1 ng-5 μg總RNA可建立20 μl反應體(ti) 係，如果總RNA量大於(yu) 5 μg，請按比例擴大反應體(ti) 係。

 i逆轉錄操作步驟：

1．將RNA模板、Primer Mix、dNTP Mix、RT  Buffer、SuperRT和RNase-Free Water

   溶解並置於(yu) 冰上備用。

2．根據以下表格配置反應體(ti) 係，總體(ti) 積為(wei) 20 μl。

試劑                            20 μl反應體(ti) 係              終濃度

dNTP Mix，2.5 mM Each                 4  μl          500 μM Each

Primer Mix                           2  μl

RNA Template                         X  μl           50 pg-5 μg

5×RT Buffer                          4  μl               1×

SuperRT，200 U/μl                     1  μl

RNase-Free Water                 up to 20  μl

   注意：1）若起始RNA的量小於(yu) 50 ng，則建議加入RNA酶抑製劑（RNasin）。本試劑盒並未提供，如需要可單獨向本公司訂購，貨號：YJ0596。

   2）Primer Mix由Oligo（dT）和Random Primer配製而成。

3．渦旋震蕩混勻，短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。

4．42℃孵育30-50分鍾，85℃孵育5分鍾。反應結束後，短暫離心，置於(yu) 冰上冷卻。

5．逆轉錄產(chan) 物可直接用於(yu) PCR反應和熒光定量PCR反應，或置於(yu) -20℃長期保存。

ii  若逆轉錄效率低，或RNA模板二級結構複雜、GC含量高時，建議采用以下步驟：

1．將RNA模板、Primer Mix、dNTP Mix、RT  Buffer、SuperRT和RNase-Free Water

   溶解並置於(yu) 冰上備用。

2．根據以下表格配置反應體(ti) 係，總體(ti) 積為(wei) 15 μl。

試劑                           20 μl反應體(ti) 係             終濃度

dNTP Mix，2.5 mM Each                 4  μl         500 μM Each

Primer Mix                           2  μl

RNA Template                         X  μl          50 pg-5 μg

RNase-Free Water                  up to 15  μl

3．70℃孵育10分鍾，迅速冰浴2分鍾。

4．短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。

5．繼續向以上反應液中加入以下試劑：

試劑                        20 μl反應體(ti) 係                 終濃度

5×RT Buffer                    4  μl                  1×

        注意：1）若起始RNA的量小於(yu) 50 ng，則建議加入RNA酶抑製劑（RNasin）。本試劑盒並未提供，如需要可單獨向本公司訂購，貨號：YJ0596。

        2）Primer Mix由Oligo（dT）和Random primer配製而成。

     6．輕輕吹打混勻，加入1 μl SuperRT（200 U/μl），輕輕吸打混勻。42℃孵育50分鍾。

     7．85℃孵育5分鍾。反應結束後，短暫離心，置於(yu) 冰上冷卻。

     8．逆轉錄產(chan) 物可直接用於(yu) PCR反應和熒光定量PCR反應，或置於(yu) -20℃長期保存。

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