LGS1068人外周血造血幹細胞分離液說明書(shu)

人外周血造血幹細胞分離液說明書(shu)
【產(chan) 品規格】
200ml/Kit
【產(chan) 品組成】
為(wei) 方便廣大用戶使用，試劑內(nei) 容如下：

【實驗前準備】
A．適用儀(yi) 器
zui大離心力可達 1200g的水平轉子離心機
B．耗材

【檢驗方法】
全過程樣本、試劑及實驗環境均需在 20±2℃的條件下進行。
首先取抗凝血按體(ti) 積比 1:1的比例加樣本稀釋液（產(chan) 品編號：2010C1119）混勻，
根據稀釋後的樣本量大小，分以下兩(liang) 種情況：
情況 A：稀釋後的血液樣本量小於(yu) 5ml 時，實驗方法如下：
1.取一支15ml離心管，先加入與(yu) 稀釋後樣本等量的分離液（注：分離液zui少不得少於(yu)   3ml）。
2.用吸管小心吸取稀釋後的血液樣本加於(yu) 分離液液麵上，400-500g，離心20-30min（注：
根據血液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時間越長，具體(ti) 離
心條件需客戶自行摸索，以達到分離效果）。
 3.離心後，此時離心管中由上至下分為(wei) 四層。*層為(wei) 血漿層。第二層為(wei) 環狀乳白色目的

細胞層。第三層為(wei) 透明分離液層。第四層為(wei) 紅細胞層。
4.用吸管小心吸取第二層環狀乳白色目的細胞層到另一 15ml離心管中，往所得離心管中
加入 10ml清洗液（產(chan) 品編號：2010X1118），混勻細胞。
5. 250g，離心 10min。
6.棄上清。
7.用吸管以5ml清洗液（產(chan) 品編號：2010X1118）重懸所得細胞。
8. 250g，離心 10min。
9.重複  6、7、8，棄上清後以 0.5ml後續實驗所需相應液體(ti) 重懸細胞。
10.差異貼壁法純化細胞
（1）用幹細胞無血清培養(yang) 基或幹細胞*培養(yang) 基以 1.5-3×10 6個(ge) /ml的密度重懸細胞，將細胞鋪於(yu) 一次性細胞板或細胞瓶中，放於(yu)  37℃二氧化碳培養(yang) 箱中進行貼壁培養(yang) 。
（2）2-4小時內(nei) 貼壁的為(wei) 巨噬細胞前體(ti) （俗稱為(wei) 單核細胞）。
（3）10-24小時內(nei) 貼壁的單個(ge) 核細胞為(wei) 內(nei) 皮、內(nei) 皮祖細胞、幹細胞。
（4）不貼壁的為(wei) 淋巴細胞。
注：
a)
無血清培養(yang) 基中不含任何動物成分，為(wei) 得到更佳培養(yang) 效果可添加10%自體(ti) 血漿或
2-8% 經篩選的胎牛血清。
b)
c)
*培養(yang) 基中含 2-20% 胎牛血清（血清具體(ti) 含量由所培養(yang) 的目的細胞而定）。
由於(yu) 每種細胞的貼壁時間存在差異可將所得細胞分開已達簡單的純化目的，此法成
本相對較低。如需獲得高純度目的細胞則需在使用分離液後選用免疫磁珠陽性或陰
性分選。
情況 B：稀釋後的血液樣本量大於(yu) 等於(yu)  5ml時，實驗方法如下：
1.取一支適當的離心管，先加入與(yu) 稀釋後樣本等量的分離液。
2.將經稀釋後的血液樣本小心加於(yu) 分離液之液麵上，450-650g（zui大離心力可至 1000g），
離心 20-30min。（注：根據血液樣本量確定離心條件，血液量越多，離心力越大，離心
時間越長，具體(ti) 離心條件需客戶自行摸索，以達到分離效果。加入血液樣本後，樣
本及分離液總體(ti) 積不得超過離心管總體(ti) 積的三分之二）。
3.剩餘(yu) 步驟同“情況  A”中步驟 3至步驟  10。
  【注意事項】

1.全過程樣本、試劑及實驗環境均需在   20±2℃的條件下進行。為(wei) 獲得的實驗結果，
在取血 2h內(nei) 進行實驗，血液存放時間越長，細胞分離效果越差。血液放置超過   6h
後分離效果更差甚至不能達到分離目的。
2.本實驗不使用高聚合材質（如聚苯乙烯）的塑料製品，應使用無靜電、低靜電離心
管及未經堿處理過後的玻璃製品，因為(wei) 靜電作用將導致細胞貼壁、堿處理的玻璃表麵會(hui)
變成毛麵，影響細胞分離效果。
3.吸取過多的目的細胞層及分離液層會(hui) 導致分離液交界處的粒細胞被吸出從(cong) 而使混雜的粒
細胞數量增加。
4.吸取過多的目的細胞層上層溶液會(hui) 導致血漿蛋白及血小板混雜。
5.分離液用量大於(yu) 稀釋後的血液樣本時，分離效果更佳。
6.如實驗後幹細胞得率或活性過低，請以尋求幫助。
【儲(chu) 存條件及有效期】
18-25℃保存，有效期 2年。本品易感染細菌，需無菌條件操作。無菌條件下操作，啟
封後置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現白色結晶，影響分離效果。
【參考值（參考範圍）】
本實驗外周血幹細胞提取率大於(yu)  80%。
下表為(wei) 成年人外周血中各種細胞的數量及比例，用戶可適當進行參考。

【相關(guan) 實驗技術方案】
1.所獲得幹細胞的培養(yang) 技術。
2.所獲得幹細胞的核酸提取技術。
3.所獲得幹細胞的鑒定方法
A.流式細胞技術
B.免疫組化技術
C.原位雜交技術
D.PCR技術

注：上述技術方案詳情請登陸本搜索“細胞分離、
純化、擴增、鑒定及生物治療技術手冊(ce) ”，並在說明書(shu) 項目欄下下載使用。
【可能存在的問題及解決(jue) 方法】
1.由於(yu) 血液粘度、細胞密度等差異可能造成的問題及解決(jue) 方案如下表所示：

2.本分離液分離細胞的原理為(wei) 密度梯度離心，其密度與(yu) 溫度、大氣壓等密切相關(guan) 。不同地
區客戶可根據當地情況對離心條件進行適當調整。建議對離心條件進行調整時，恒定離
心時間，對離心轉速進行調整。
3.本分離液依照標準，全部使用藥用級原料，性能指標與(yu) 國產(chan) 同類產(chan) 品略有不同，可
能出現紅細胞沉降不*的情況，可以適當加大離心轉速。
注：在對離心條件進行調整時，離心轉速的加減以 50-100g為(wei) 基數，直至達到分離效果，
離心力zui小不得小於(yu)  400g，zui大不得大於(yu)  1200g。離心時間以 20-30min為(wei) 準。