蛋白質提取與(yu) 純化技術

選擇材料及預處理

以蛋白質和結構與(yu) 功能為(wei) 基礎，從(cong) 分子水平上認識生命現象，已經成為(wei) 現代生物學發展的主要方向，研究蛋白質，首先要得到高度純化並具有生物活性的目的物質。蛋白質的製備工作涉及物理、化學和生物等各方麵知識，但基本原理不外乎兩(liang) 方麵。一是得用混合物中幾個(ge) 組分分配率的差別，把它們(men) 分配到可用機械方法分離的兩(liang) 個(ge) 或幾個(ge) 物相中，如鹽析，有機溶劑提取，層析和結晶等；二是將混合物置於(yu) 單一物相中，通過物理力場的作用使各組分分配於(yu) 來同區域而達到分離目的，如電泳，超速離心，超濾等。在所有這些方法的應用中必須注意保存生物大分子的完整性，防止酸、鹼、高溫，劇烈機械作用而導致所提物質生物活性的喪(sang) 失。蛋白質的製備一般分為(wei) 以下四個(ge) 階段：選擇材料和預處理，細胞的破碎及細胞器的分離，提取和純化，濃細、幹燥和保存。

　　微生物、植物和動物都可做為(wei) 製備蛋白質的原材料，所選用的材料主要依據實驗目的來確定。對於(yu) 微生物，應注意它的生長期，在微生物的對數生長期，酶和核酸的含量較高，可以獲得高產(chan) 量，以微生物為(wei) 材料時有兩(liang) 種情況：

（1）得用微生物菌體(ti) 分泌到培養(yang) 基中的代謝產(chan) 物和胞外酶等；

（2）利用菌體(ti) 含有的生化物質，如蛋白質、核酸和胞內(nei) 酶等。植物材料必須經過去殼，脫脂並注意植物品種和生長發育狀況不同，其中所含生物大分子的量變化很大，另外與(yu) 季節性關(guan) 係密切。對動物組織，必須選擇有效成份含量豐(feng) 富的髒器組織為(wei) 原材料，先進行絞碎、脫脂等處理。另外，對預處理好的材料，若不立即進行實驗，應冷凍保存，對於(yu) 易分解的生物大分子應選用新鮮材料製備。

蛋白質的分離純化

一，蛋白質（包括酶）的提取

　　大部分蛋白質都可溶於(yu) 水、稀鹽、稀酸或堿溶液，少數與(yu) 脂類結合的蛋白質則溶於(yu) 乙醇、丙酮、丁醇等有機溶劑中，因些，可采用不同溶劑提取分離和純化蛋白質及酶。

（一）水溶液提取法

　　稀鹽和緩衝(chong) 係統的水溶液對蛋白質穩定性好、溶解度大、是提取蛋白質zui常用的溶劑，通常用量是原材料體(ti) 積的1-5倍，提取時需要均勻的攪拌，以利於(yu) 蛋白質的溶解。提取的溫度要視有效成份性質而定。一方麵，多數蛋白質的溶解度隨著溫度的升高而增大，因此，溫度高利於(yu) 溶解，縮短提取時間。但另一方麵，溫度升高會(hui) 使蛋白質變性失活，因此，基於(yu) 這一點考慮提取蛋白質和酶時一般采用低溫（5度以下）操作。為(wei) 了避免蛋白質提以過程中的降解，可加入蛋白水解酶抑製劑（如二異丙基氟磷酸，碘乙酸等）。

下麵著重討論提取液的pH值和鹽濃度的選擇。

1、pH值
　　蛋白質，酶是具有等電點的兩(liang) 性電解質，提取液的pH值應選擇在偏離等電點兩(liang) 側(ce) 的pH 範圍內(nei) 。用稀酸或稀堿提取時，應防止過酸或過堿而引起蛋白質可解離基團發生變化，從(cong) 而導致蛋白質構象的不可逆變化，一般來說，堿性蛋白質用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白質用偏堿性的提取液。

2、鹽濃度
　　稀濃度可促進蛋白質的溶，稱為(wei) 鹽溶作用。同時稀鹽溶液因鹽離子與(yu) 蛋白質部分結合，具有保護蛋白質不易變性的優(you) 點，因此在提取液中加入少量NaCl等中性鹽，一般以0.15摩爾。升濃度為(wei) 宜。緩衝(chong) 液常采用0.02-0.05M磷酸鹽和碳酸鹽等滲鹽溶液。

（二）有機溶劑提取法

　　一些和脂質結合比較牢固或分子中非極性側(ce) 鏈較多的蛋白質和酶，不溶於(yu) 水、稀鹽溶液、稀酸或稀堿中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑，它們(men) 具的一定的親(qin) 水性，還有較強的親(qin) 脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必須在低溫下操作。丁醇提取法對提取一些與(yu) 脂質結合緊密的蛋白質和酶特別*，一是因為(wei) 丁醇親(qin) 脂性強，特別是溶解磷脂的能力強；二是丁醇兼具親(qin) 水性，在溶解度範圍內(nei) （度為(wei) 10%，40度為(wei) 6.6%）不會(hui) 引起酶的變性失活。另外，丁醇提取法的pH及溫度選擇範圍較廣，也適用於(yu) 動植物及微生物材料。

二、蛋白質的分離純化

蛋白質的分離純化方法很多，主要有：

（一）根據蛋白質溶解度不同的分離方法

1、蛋白質的鹽析

　　中性鹽對蛋白質的溶解度有顯著影響，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質的溶解度增加，此稱鹽溶；當鹽濃度繼續升高時，蛋白質的溶解度不同程度下降並先後析出，這種現象稱鹽析，將大量鹽加到蛋白質溶液中，高濃度的鹽離子（如硫酸銨的SO4和NH4）有很強的水化力，可奪取蛋白質分子的水化層，使之“失水”，於(yu) 是蛋白質膠粒凝結並沉澱析出。鹽析時若溶液pH在蛋白質等電點則效果更好。由於(yu) 各種蛋白質分子顆粒大小、親(qin) 水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，因此調節混合蛋白質溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質分段沉澱。

　　影響鹽析的因素有：

（1）溫度：除對溫度敏感的蛋白質在低溫（4度）操作外，一般可在室溫中進行。一般溫度低蛋白質溶介度降低。但有的蛋白質（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白）在較高的溫度（25度）比0度時溶解度低，更容易鹽析。

（2）pH值：大多數蛋白質在等電點時在濃鹽溶液中的溶介度zui低。

（3）蛋白質濃度：蛋白質濃度高時，欲分離的蛋白質常常夾雜著其他蛋白質地一起沉澱出來（共沉現象）。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質含量在2.5-3.0%。

　　蛋白質鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。 其中應用zui多的硫酸銨，它的優(you) 點是溫度係數小而溶解度大（25度時飽和溶液為(wei) 4.1M，即767克/升；0度時飽和溶解度為(wei) 3.9M，即676克/升），在這一溶解度範圍內(nei) ，許多蛋白質和酶都可以鹽析出來；另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，不易引起蛋白質變性。硫酸銨溶液的pH常在4.5-5.5之間，當用其他pH值進行鹽析時，需用硫酸或氨水調節。

　　蛋白質在用鹽析沉澱分離後，需要將蛋白質中的鹽除去，常用的辦法是透析，即把蛋白質溶液裝入秀析袋內(nei) （常用的是玻璃紙），用緩衝(chong) 液進行透析，並不斷的更換緩衝(chong) 液，因透析所需時間較長，所以在低溫中進行。此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過柱的辦法除鹽，所用的時間就比較短。

2、等電點沉澱法

　　蛋白質在靜電狀態時顆粒之間的靜電斥力zui小，因而溶解度也zui小，各種蛋白質的等電點有差別，可利用調節溶液的pH達到某一蛋白質的等電點使之沉澱，但此法很少單獨使用，可與(yu) 鹽析法結合用。

3、低溫有機溶劑沉澱法

　　用與(yu) 水可混溶的有機溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數蛋白質溶解度降低並析出，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質較易變性，應在低溫下進行。

（二）根據蛋白質分子大小的差別的分離方法

1、透析與(yu) 超濾

　　透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質分開。

　　超濾法是利用高壓力或離心力，強使水和其他小的溶質分子通過半透膜，而蛋白質留在膜上，可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質。

2、凝膠過濾法

　　也稱分子排阻層析或分子篩層析，這是根據分子大小分離蛋白質混合物zui有效的方法之一。柱中zui常用的填充材料是葡萄糖凝膠（Sephadex ged）和瓊脂糖凝膠（agarose gel）。

（三）根據蛋白質帶電性質進行分離

蛋白質在不同pH環境中帶電性質和電荷數量不同，可將其分開。

1、電泳法

　　各種蛋白質在同一pH條件下，因分子量和電荷數量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳，這是利用一種兩(liang) 性電解質作為(wei) 載體(ti) ，電泳時兩(liang) 性電解質形成一個(ge) 由正極到負極逐漸增加的pH梯度，當帶一定電荷的蛋白質在其中泳動時，到達各自等電點的pH位置就停止，此法可用於(yu) 分析和製備各種蛋白質。

2、離子交換層析法

　　離子交換劑有陽離子交換劑（如：羧甲基纖維素；CM-纖維素）和陰離子交換劑（二乙氨基乙基纖維素；DEAE?FONT FACE="宋體(ti) " LANG="ZH-CN">纖維素），當被分離的蛋白質溶液流經離子交換層析柱時，帶有與(yu) 離子交換劑相反電荷的蛋白質被吸附在離子交換劑上，隨後用改變pH或離子強度辦法將吸附的蛋白質洗脫下來。（詳見層析技術章）

（四）根據配體(ti) 特異性的分離方法－親(qin) 和色譜法

　　親(qin) 和層析法（aflinity chromatography）是分離蛋白質的一種極為(wei) 有效的方法，它經常隻需經過一步處理即可使某種待提純的蛋白質從(cong) 很複雜的蛋白質混合物中分離出來，而且純度很高。這種方法是根據某些蛋白質與(yu) 另一種稱為(wei) 配體(ti) （Ligand）的分子能特異而非共價(jia) 地結合。其基本原理：蛋白質在組織或細胞中是以複雜的混合物形式存在，每種類型的細胞都含有上千種不同的蛋白質，因此蛋白質的分離（Separation），提純（Purification）
和鑒定（Characterization）是生物化學中的重要的一部分，至今還沒的單獨或一套現成的方法能移把任何一種蛋白質從(cong) 複雜的混合蛋白質中提取出來，因此往往采取幾種方法聯合使用。

細胞的破碎

1、高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置於(yu) 筒內(nei) 約1/3體(ti) 積，蓋緊筒蓋，將調速器先撥至zui慢處，開動開關(guan) 後，逐步加速至所需速度。此法適用於(yu) 動物內(nei) 髒組織、植物肉質種子等。

2、玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置於(yu) 管中，再套入研杆來回研磨，上下移動，即可將細胞研碎，此法細胞破碎程度比高速組織搗碎機為(wei) 高，適用於(yu) 量少和動物髒器組織。

3、超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇震蕩破裂，此法多適用於(yu) 微生物材料，用大腸杆菌製備各種酶，常選用50-100毫克菌體(ti) /毫升濃度，在1KG至10KG頻率下處理10-15分鍾，此法的缺點是在處理過程會(hui) 產(chan) 生大量的熱，應采取相應降溫措施。對超聲波敏感和核酸應慎用。

4、反複凍融法：將細胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反複幾次，由於(yu) 細胞內(nei) 冰粒形成和剩餘(yu) 細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結構破碎。

5、化學處理法：有些動物細胞，例如腫瘤細胞可采用十二烷基磺酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉等細胞膜破壞，細菌細胞壁較厚，可采用溶菌酶處理效果更好。

　　無論用哪一種方法破碎組織細胞，都會(hui) 使細胞內(nei) 蛋白質或核酸水解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導致天然物質量的減少，加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑製或減慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑製那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力，但不是全部，還可通過選擇pH、溫度或離子強度等，使這些條件都要適合於(yu) 目的物質的提取。

濃縮、幹燥及保存
一、樣品的濃縮
　　生物大分子在製備過程中由於(yu) 過柱純化而樣品變得很稀，為(wei) 了保存和鑒定的目的，往往需要進行濃縮。常用的濃縮方法的：

1、減壓加溫蒸發濃縮
　　通過降低液麵壓力使液體(ti) 沸點降低，減壓的真空度愈高，液體(ti) 沸點降得愈低，蒸發愈快，此法適用於(yu) 一些不耐熱的生物大分子的濃縮。

2、空氣流動蒸發濃縮 空氣的流動可使液體(ti) 加速蒸發,鋪成薄層的溶液，表麵不斷通過空氣流；或將生物大分子溶液裝入透析袋內(nei) 置於(yu) 冷室，用電扇對準吹風，使透過膜外的溶劑不沁蒸發，而達到濃縮目的，此法濃縮速度慢，不適於(yu) 大量溶液的濃縮。

3、冰凍法 生物大分子在低溫結成冰，鹽類及生物大分子不進入冰內(nei) 而留在液相中，操作時先將待濃縮的溶液冷卻使之變成固體(ti) ，然後緩慢地融解，利用溶劑與(yu) 溶質融點介點的差別而達到除去大部分溶劑的目的。如蛋白質和酶的鹽溶液用此法濃縮時，不含蛋白質和酶的純冰結晶浮於(yu) 液麵，蛋白質和酶則集中於(yu) 下層溶液中，移去上層冰塊，可得蛋白質和酶的濃縮液。

4、吸收法 通過吸收劑直接收除去溶液中溶液分子使之濃縮。所用的吸收劑必需與(yu) 溶液不起化學反應，對生物大分子不吸附，易與(yu) 溶液分開。常用的吸收劑有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝膠等，使用聚乙二醇吸收劑時，先將生物大分子溶液裝入半透膜的袋裏，外加聚乙二醇複蓋置於(yu) 4度下，袋內(nei) 溶劑滲出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水飽和後要更換新的直至達到所需要的體(ti) 積。

5、超濾法 超濾法是使用一種特別的薄膜對溶液中各種溶質分子進行選擇性過濾的方法，不液體(ti) 在一定壓力下（氮氣壓或真空泵壓）通過膜時，溶劑和小分子透過，大分子受阻保留，這是近年來發展起來的新方法，zui適於(yu) 生物大分子尤其是蛋白質和酶的濃縮或脫鹽，並具有成本低，操作方便，條件溫和，能較好地保持生物大分子的活性，回收率高等優(you) 點。應用超濾法關(guan) 鍵在於(yu) 膜的選擇，不同類型和規格的膜，水的流速，分子量截止值（即大體(ti) 上能被膜保留分子zui小分子量值）等參數均不同，必須根據工作需要來選用。另外，超濾裝置形式，溶質成份及性質、溶液濃度等都對超濾效果的一定影響。Diaflo 超濾膜的分子量截留值：

膜名稱 分子量截留值 孔的大的平均直徑
XM－300 300，000               140
XM－200 100，000                55
XM－50 50，000                30
PM－30  30，000                22
UM－20 20，000                18
PM－10 10，000                15
UM－2 1，000                12
UM05 500                 10

　　用上麵的超濾膜製成空心的纖維管，將很多根這樣的管攏成一束，管的兩(liang) 端與(yu) 低離子強度的緩衝(chong) 液相連，使緩衝(chong) 液不斷地在管中流動。然後將纖維管浸入待透析的蛋白質溶液中。當緩衝(chong) 液流過纖維管時，則小分子很易透過膜而擴散，大分子則不能。這就是纖維過濾秀析法，由於(yu) 透析麵積增大，因而使透析時間縮短10倍。

二、幹燥
　　生物大分子製備得到產(chan) 品，為(wei) 防止變質，易於(yu) 保存，常需要幹燥處理，zui常用的方法是冷凍幹燥和真空幹燥。真空幹燥適用於(yu) 不耐高溫，易於(yu) 氧化物質的幹燥和保存，整個(ge) 裝置包括幹燥器、冷凝器及真空幹燥原理外，同時增加了溫度因素。在相同壓力下，水蒸汽壓隨溫度下降而下降，故在低溫低壓下，冰很易升華為(wei) 氣體(ti) 。操作時一般先將待幹燥的液體(ti) 冷凍到冰點以下使之變成固體(ti) ，然後在低溫低壓下將溶劑變成氣體(ti) 而除去。此法幹後的產(chan) 品具有疏鬆、溶解度好、保持天然結構等優(you) 點，適用於(yu) 各類生物大分子的幹燥保存。

三、貯存
　　生物大分子的穩定性與(yu) 保存方法的很大關(guan) 係。幹燥的製品一般比較穩定，在低溫情況下其活性可在數日甚至數年無明顯變化，貯藏要求簡單，隻要將幹燥的樣品置於(yu) 幹燥器內(nei) （內(nei) 裝有幹燥劑）密封，保持0－4度冰箱即可，液態貯藏時應注意以下幾點。

1、樣品不能太稀，必須濃縮到一定濃度才能封裝貯藏，樣品太稀易使生物大分子變性。

2、一般需加入防腐劑和穩定劑，常用的防腐劑有甲苯、苯甲酸、氯仿、百裏酚等。蛋白質和酶常用的穩定劑有硫酸銨糊、蔗糖、甘油等，如酶也可加入底物和輔酶以提高其穩定性。此外，鈣、鋅、硼酸等溶液對某些酶也有一定保護作用。核酸大分子一般保存在氯化鈉或檸檬酸鈉的標準緩衝(chong) 液中。

3、貯藏溫度要求低，大多數在0度左右冰箱保存，有的則要求更低，應視不同物質而定。

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