免疫組織化學工作流程

1 石蠟切片脫蠟和水化後，用PBS（PH7.4）衝(chong) 洗三次，每次5分鍾。
PBS配製 （2000ml）PH7.4
氯化鈉： 17g
磷酸二氫鈉：0.4g
磷酸氫二鈉：6.3g
2 根據每一種抗體(ti) 的要求，對組織抗原進行相應的修複。我科采用壓力鍋進行抗原修複，取一定量的修複液於(yu) 壓力鍋中，加熱至沸騰，將脫蠟水化後的組織切片置於(yu) 不鏽鋼或耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩衝(chong) 液中，蓋上鍋蓋，扣上壓力閥，繼續加熱至噴氣，從(cong) 噴氣開始計時，2分鍾後，壓力鍋離開熱源，冷卻至室溫（也可以稍冷後，在自來水下加速冷卻）。取出玻片，先用蒸餾水衝(chong) 洗兩(liang) 遍（用蠟在組織周圍劃圈，防止抗體(ti) 跑散，但圈要大一點），之後用PBS（PH7.4）衝(chong) 洗三遍。每次5分鍾。
檸檬酸緩衝(chong) 液的配製（PH6.0）
0.1M檸檬酸：（4.2g+200ml蒸餾水）
0.1M檸檬酸三鈉 （14.7g+500ml蒸餾水）
取檸檬酸三鈉41ml+檸檬酸9ml加入450ml蒸餾水中，總量為(wei) 500ml即可。
3  配製3%過氧化氫阻斷內(nei) 源性過氧化物酶，孵育十分鍾。
PBS90 ml+30 %過氧化氫10 ml，現用現配並搖勻，蓋上蓋子，防止見氧分解揮發。
4  PBS衝(chong) 洗三次，每次5分鍾。
5  滴加4 %羊血清封閉，室溫30分鍾，以減少非特異性染色。
PBS10 ml+正常羊血清400 ul
6  甩去羊血清，根據不同的項目配製並滴加不同的一抗，濃縮型的抗體(ti) 一定要在購買(mai) 後先用已知的陽性片做梯度實驗，根據結果情況找出*稀釋濃度再用到臨(lin) 床診斷。工作液也應該在購買(mai) 後先用已知的陽性片檢測抗體(ti) 的染色效果，直接滴加即可。每次還應帶上陽性對照和陰性對照，以保證結果的可靠性。每張切片滴加足夠量的一抗並放入濕盒，防止切片幹燥影響結果，室溫孵育2小時。
抗體(ti) 稀釋液的配製 牛血清白蛋白：2mg
疊氮鈉： 10～20ml
雙蒸水： 10ml
7  PBS衝(chong) 洗三次，每次5分鍾。
8  滴加二步法EnVision TM孵育30分鍾。
9  PBS衝(chong) 洗三次，每次5分鍾。
10  甩去PBS液，每張切片滴加新鮮配製的DAB顯色液，顯微鏡下觀察，陽性信號為(wei) 棕黃色或棕褐色。一般顯色時間為(wei) 5分鍾左右，終止反應，自來水充分衝(chong) 洗。
11  蘇木素複染，0.1%鹽酸酒精分化，氨水返蘭(lan) 或自來水返蘭(lan) （自來水返蘭(lan) 時間要稍長些，應該在顯微鏡下看以下蘇木素複染情況），自來水衝(chong) 洗。
12  梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，閱片並總結染色結果。