真核表達載體(ti) 構建實驗服務

一.服務介紹

分子克隆是在分子水平上提供一種純化和擴 增特定DNA片段的方法。常含有目的基因,用體(ti) 外重組方法將它們(men) 插入克隆載體(ti) ，形成重組克隆載體(ti) ,通過轉化與(yu) 轉導的方式，引入適合的寄主體(ti) 內(nei) 得到複製與(yu) 擴增，然後再從(cong) 篩選的寄主細胞內(nei) 分離提純所需的克隆載體(ti) ，可以得到插入DNA的許多拷貝，從(cong) 而獲得目的基因的擴增。

二、實驗原理

外源DNA與(yu) 載體(ti) 分子的連接就是DNA重組，這樣重新組合的DNA叫做重組體(ti) 或重組子。重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下,有Mg2+、ATP存在的連接緩衝(chong) 係統中，將分別經酶切的載體(ti) 分子與(yu) 外源DNA分子進行連接。DNA連接酶有兩(liang) 種: T4噬菌體(ti) DNA連接酶和大腸杆菌DNA連接酶。兩(liang) 種DNA連接酶都有將兩(liang) 個(ge) 帶有相同粘性末端的DNA分子連在--起的功能， 而且T4噬菌體(ti) DNA連接酶還有一種大腸杆菌連接酶沒有的特性，即能使兩(liang) 個(ge) 平末端的雙鏈DNA分子連接起來。但這種連接的效率比粘性末端的連接效率低，一般可通過提高T4噬菌體(ti) DNA連接酶濃度或增加DNA濃度來提高平末端的連接效率。T4噬菌體(ti) DNA連接酶催化DNA連接反應分為(wei) 3步:首先，T4DNA連接酶與(yu) 輔助因子ATP形成酶- AMP複合物;然後,酶一AMP複台物再結合到具有5磷酸基和3羥基切口的DNA上，使DNA腺苷化;後產(chan) 生一個(ge) 新的磷酸二酯鍵， 把切口封起來。

DNA重組的方法主要有粘端連接法和平端連接法，為(wei) 了防止載體(ti) 本身的自連，可以通過(牛小腸堿性磷酸酶)CIP處理克服。

連接反應的溫度在37°C時有利於(yu) 連接酶的活性但是在這個(ge) 溫度下，粘性末端的氫鍵結合是不穩定的。因此人們(men) 找到了一個(ge) 折中溫度，即12-16°C， 連接12-16h(過夜), 這樣既可大限度地發揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對結構的穩定。

三、實驗流程

1.目的DNA的擴增和純化;

2.連接反應;

3.電泳檢測連接產(chan) 物。

四、客戶提供

樣本DNA，基因序列,試劑盒。

五、公司提供

構建好的載體(ti) ，電泳膠圖，測序結果。

其他18luck赞助服務