凋亡因子Caspase-389檢測實驗

Caspase3

Caspase是- -個(ge) 在細胞凋亡過程中起重要作用的蛋白酶家族。Caspase3也稱CPP32, 是細胞凋亡過程中的一個(ge) 關(guan) 鍵酶，可以剪切procaspase2.6. 7和9，並可以直接特異性剪切許多caspase底物，包括PARP (poly(ADP-ribose) polymerase), ICAD (Inhibitor of caspase-activated Deoxyri- bonuclease), gelsolin和fodrin等。 這些由caspase 3介導的蛋白剪切是細胞凋亡分子機製的重要組成部分。caspase 3在細胞核凋亡過程中也起到了關(guan) 鍵作用，包括染色質固

縮，DNA片段化等。同時caspase 3對細胞起泡(Cell blebbing)也起到關(guan) 鍵作用。

檢測原理基於(yu) casepase 3可以催化底物AC-DEVD-pNA產(chan) 生黃色的pNA(-itroaniline),從(cong) 而可以通過測定吸光度來檢測caspase 3的活性。pNA在405nm附近有強吸收。參照黃色產(chan) 物pNA製作的標準曲線，可以作為(wei) 定量caspase 3酶活性的標準品。

Caspase-8

Caspase 8通常以酶原的形式存在，在細胞凋亡的信號轉導過程中被激活，Caspase 8被認為(wei) 是細胞凋亡信號轉導過程中上遊的caspase,在Fas-receptor和TNFR-1介導的細胞凋亡 過程中caspase 8被激活,形成一個(ge) 由p18和p10組成的二聚體(ti) ，進一步激活下遊的caspase 4, caspase 6。caspase 9和caspase 10。本方法基於(yu) Caspase 8可以催化底物AC-IETD-pNA產(chan) 生黃色的pNA (-nitraniline),從(cong) 而可以通過測定吸光度來檢測Caspase 8的活性。pNA在405nm附近有強吸收。 檢測樣本的405nm OD值參照pNA製作的標準曲線，可以計算樣品的Caspase 8酶活性。

Caspase-9

Caspase 9也稱ICE-LAP6或Mch6,是細胞凋亡信號轉導過程中上遊的caspase。線粒體(ti) 釋放細胞色素c以後，caspase 9可以和細胞色素c以及Apaf1形成複合物，同時被激活。激活的caspase 9可以激活細胞凋的關(guan) 鍵酶caspase 3,從(cong) 而促進後續的細胞凋亡信號。Caspase 9的激活可以通過磷酸化進行調控。

本方法基於(yu) Caspase 9可以催化底物Ac- LEHD -pNA產(chan) “生黃色的pNA (p-nitroaniline),從(cong) 而可以通過測定吸光度來檢測

Caspase 9的活性。pNA在405nm附近有強吸收。檢測樣本的405nm OD值參照pNA製作的標準曲線，可以計算樣品的Caspase 9酶活性。

Caspase1

Caspase2

Caspase4

Caspase6

凋亡因子Caspase 3/8/9檢測樣本準備:

1)細胞樣品:取1x107個(ge) 細胞(約1個(ge) T25的培養(yang) 瓶細胞量) , 600g 4°C離心5分鍾收集細胞，小心吸除上清，PBS洗滌一次。吸取上清後，每管細胞樣品加入100u|裂解液重懸沉澱,冰浴裂解15分鍾。4°C 16,000g離心10-15分鍾， 把上清轉移到冰浴預冷的離心管中。立即測定caspase 3的酶活性或-70°C保存樣品。同時可以取少量樣品用Bradford法測定蛋白濃度，盡量使蛋白濃度達到1-3mg/ml.

2)組織樣品:約每10mg組織加入100ul裂解液，在冰浴上用玻璃勻漿器勻漿。然後把勻漿液轉移到1 .5ml)離心管中，冰浴再裂解5分鍾。4°C 16,000g離心10-15分鍾，把上清轉移到冰浴預冷的離心管中。立即測定caspase 3的酶活性或-70°C保存

樣品。同時可以取少量樣品用Bradford法測定蛋白濃度，盡量使蛋白濃度達到1-3mg/ml.

Caspase-3活性檢測標準曲線

實驗周期: 7-10個(ge) 工作日內(nei) 完成，重複檢測優(you) 惠。

客戶注意事項

1.抗體(ti) :事先谘詢上海研謹生物，明確抗體(ti) 種屬以及是否有該抗體(ti) 可使用。如無可由雙方協商而定，客戶自己購買(mai) 提供或我公司代購;

2.標本收集與(yu) 保存:

①組織樣品:新鮮組織放入液氮或70度保存,組織不少於(yu) 100mg (約綠豆大小) ;

②培養(yang) 細胞:通過細胞計數取不少於(yu) 000000個(ge) 細胞於(yu) EP管，加入0.5ml生理鹽水或蛋白保護劑，混勻後保存於(yu) 冰箱(-70°C，避免反複凍融) ;

③血液細胞標本:以抗凝管保存血樣或以淋巴細胞分離液分離細胞後加入0.5ml生理鹽水或蛋白保護劑，保存(-70°C可長期保存，避免反複凍融)

④血清或細胞培養(yang) 液標本:離心去掉雜質後取上清入EP管，保存(以上4°C可保存15-20天，-70°C可長期保存，避免反複凍融)

3、樣本運輸:可選以下任何的一種方式寄送標本

①組織樣本、細胞樣本以幹冰運輸或加入蛋白保護劑後加冰袋運輸;

②細胞樣本也可以直接快件寄送培養(yang) 瓶(密封保證不汙染，培養(yang) 液不漏出,細胞不要長得太滿，50%左右,灌滿培養(yang) 液) ;

③血清或上清液直接加冰袋寄送(密封保證液體(ti) 不漏出，視路途遠近2-3天可到達)。

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