蛋白雙向2D-WB 電泳實驗服務

實驗技術簡介

2D-WB是雙向電泳與(yu) 傳(chuan) 統western blot結合而成的一項技術。一般實驗流程 為(wei) 抗原蛋白混合物先經雙向電泳分離,然後將凝膠蛋白轉印至支持膜上，再通過抗體(ti) 雜交顯色。2D-WB技術可以檢測到抗原等電點或分子量發生的微小變化，在蛋白翻譯後修飾的研究中有很好的應用;而2D-WB結合質譜鑒定技術，可以從(cong) 蛋白混合物中找到免疫原性更強的抗原。

2D Westerm blot概述

2D-WB是雙向電泳與(yu) 傳(chuan) 統western blot結合而成的一項技術。一般實驗流程 為(wei) 抗原蛋白混合物先經雙向電泳分離，然後將凝膠蛋白轉印至支持膜上，再通過抗體(ti) 雜交顯色。2D-WB技術可以檢測到抗原等電點或分子量發生的微小變化，在蛋白翻譯後修飾的研究中有很好的應用;而2D-WB結合質譜鑒定技術，可以從(cong) 蛋白混合物中找到免疫原性更強的抗原。

2D Western blot技術服務內(nei) 容

1、蛋白質抽提與(yu) 定量;

2、雙向電泳;

3、轉膜，封閉，孵育,顯示成像。

實驗操作流程

1、第--項電泳(IEF) ,膠條平衡，第二項電泳SDS-APGE.

2、第二項電泳結束後，取出凝膠進行轉膜，轉膜方法可選擇濕法轉移和半幹法轉移。常用的膜是NC膜和PVDF膜。

3、封閉，5%脫脂奶粉或5% BSA封閉1小時(室溫)或過夜(4度)。

4、一抗孵育,根據抗體(ti) 說明書(shu) 選擇孵育時間，常規的孵育條件是室溫1小時或4度過夜，一抗孵育後取出膜

TBST洗滌3次，每次5分鍾。

5、二抗孵育:根據一抗選擇合適的二抗(抗鼠、抗人、抗兔等)，室溫孵育1小時後取出膜TBST洗滌3次,每次5分鍾。

6、顯影:將A、B底物按比例稀釋混台均勻後滴在膜上，暗室中將膠片置於(yu) 膜上,蓋上壓片夾,曝光一定時間後將膠片放入顯影液中進行顯影，直到出現清晰的蛋白質條帶，清水漂洗一下後在定影液中定影， 曝光時間需綜台考慮蛋白質的上樣量，抗體(ti) 稀釋濃度，抗體(ti) 孵育時間等因素。

7、定影後，清洗膠片，晾幹，標定marker,掃描圖片和2D Western blot圖片分析。

送樣須知，為(wei) 了保證2D Western blot技術服務能順利進行,樣品寄送需滿足以下要求:

1、顧客提供:組織、細胞、蛋白質溶液等; 一抗(可交由研謹公司代購)。

2、運輸要求:幹冰或液氮包裝寄送。

注:樣本應避免各類汙染和反複凍融。

2D Western blot技術服務報告內(nei) 容

1、蛋白質定量結果及電泳上樣量;

2、原始膠片、電子圖片及圖片分析結果;

3、2D Western blot完整的實驗報告，包括實驗步驟、使用儀(yi) 器和試劑等。

附: 2D Western blot實驗步驟

1、2D Western blot蛋白質樣本製備,製備的主要原則是盡可能溶解全部蛋白質，破壞蛋白質與(yu) 蛋白質間的相互作用，避免各類幹擾物質，樣品製備與(yu) IEF兼容等。

2、雙向電泳的主要步驟，第-項電(IEF) ，膠條平衡，第二項電泳SDS-APGE.

3、第二項電泳結束後，取出凝膠進行轉膜，轉膜方法可選擇濕法轉移和半幹法轉移。常用的膜是NC膜和PVDF膜。

4、封閉， 5%脫脂奶粉或5% BSA封閉1小時(室溫)或過夜(4度)。

5、-抗孵育,根據抗體(ti) 說明書(shu) 選擇孵育時間，常規的孵育條件是室溫1小時或4度過夜，一 抗孵育後取出膜TBST洗滌3次，每次5分鍾。

6、二抗孵育:根據-抗選擇合適的二抗(抗鼠、抗人抗兔等)， 室溫孵育1小時後取出膜TBST洗滌3次，每次5分鍾。

7、顯影:將A、B底物按比例稀釋混合均勻後滴在膜上,暗室中將膠片置於(yu) 膜上，蓋上壓片夾，曝光一定時間後將膠片放入顯影液中進行顯影，直到出現清晰的蛋白質條帶，清水漂洗一下後在定影液中定影， 曝光時間需綜合考慮蛋白質的.上樣量，抗體(ti) 稀釋濃度，抗體(ti) 孵育時間等因素。

8、定影後，清洗膠片，晾幹，標定marker,掃描圖片和2D Western blot圖片分析。

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