NF-KB p65活性檢測實驗

核轉錄因子NF-kappaB (NF-kB) 是一種重要的轉錄因子，參與(yu) 調控多種與(yu) 炎症、抗凋亡、

腫瘤形成和轉化有關(guan) 的基因表達。NF- kappaB (NF _kB)初被鑒定為(wei) 在B細胞中和免疫球蛋白k輕鏈的增強子結合。但隨後在非B-細胞的細胞質中被發現，形成NF-KB和kB的複合物。初在DNA結合蛋白複台物中分離的NF -kB是由p65(ReIA)和p50構成的異源雙聚體(ti) 。其他分離的單體(ti) 包括p49 (也可稱為(wei) p52) , p75 (C-Rel) ,p68(ReIB)。 p65,p68，p75單體(ti) 起反式激活作用。p50, p49 (p52) 單體(ti) 具有DNA結合活力，但隻具有微量的反式激活作用。據報道p49和NF-kB的單體(ti) p65形成具有轉錄活力的異源雙體(ti) ，類似於(yu) p50/ p65異源雙體(ti) 。p49/ p65和p50/ p65異源雙體(ti) 在細胞質中受一種叫kBa/MAD-3的抑製劑調節。

IkB和p65單體(ti) 結合，阻製了細胞核中的定位和DNA的結合。在體(ti) 外高濃度的p65能形成同源雙聚體(ti) ，能和DNA微弱地結合。Poly(dl:dC)能抑製這一 反應 。p49和p50也能形 成同源雙聚體(ti) ，但在細胞中的濃度很低。通常,在作NF-KB的凝膠遷移實驗時,在20ul的反應體(ti) 積中，有溶於(yu) 10 mM HEPES的0.28pmoles的NF -kB9寡核苷酸(pH7.9), 50mMKCI, 0.2mMEDTA, 2.5mM DTT, 10%甘油，0.05%NP-40。當用純化的蛋白時，250-300ng足以形成凝膠遷移複合物， 而需用10ug的Hel a細胞核抽提物。凝膠遷移複合物在室溫中保溫30分鍾，在50mMTris(pH8 3)和38mM甘氨酸的7%聚丙烯酰胺凝膠電泳中分離凝膠遷移複合物。含考馬斯蘭(lan) 和二甲苯藍色素的加樣溶液隻能加入到陰性對照反應中，因這兩(liang) 種色素會(hui) 加劇NF-kB複合物的解離。當用Hel a細胞核抽提物作為(wei) 結合蛋白來源時，可形成兩(liang) 種序列特異的凝膠遷移複合物，即p50/p50同源雙聚體(ti) 和p50/ p65異源雙聚體(ti) 。在表達p49，p50, p65的細胞中， 可檢測到4個(ge) 序例特異的凝膠遷移複合物(p49/ p49，p50/ p50，p50/ p65，p49/ p65)，如果存在高濃度的p65，可檢測到微量的p65/p65.

下列試劑可加強NF- kB在體(ti) 外的結合: mM的GTP, ATP, 精胺，亞(ya) 精胺,鋇或鈣離子，ng的

Co+3(NH3)6 (12) 。提取組織或細胞核蛋白，利用不同形式的NF -Kb p65抗體(ti) 捕獲細胞核蛋白並加以區分,通過酶標儀(yi) 450nm處測定核蛋白標準品與(yu) NF -Kb p65吸光度值，進行定量比較,從(cong) 而明確目的蛋白的活化度。

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