氯黴素快速檢測試劑盒說明書(shu)

一、原理

本試劑盒采用間接競爭(zheng) ELISA 方法，在微孔條上預包被偶聯抗原，樣本中的殘留物氯黴素將和微孔條上預包被的偶聯抗原競爭(zheng) 抗氯黴素抗體(ti) ，加入酶標記物後，用 TMB 底物顯色，樣本吸光值與(yu) 其所含殘留物氯黴素的含量成負相關(guan) ，與(yu) 標準曲線比較即可得出相應殘留物氯黴素的含量。

二、試劑盒特性

1. 試劑盒靈敏度：  0.02ppb

u 孵育溫度： 25℃

u 孵育時間： 30min～15min

1. 樣本檢測限

組織、蜂蜜、牛奶···································· 0.1ppb 奶粉、蛋類、尿樣、飼料··························· 0.15ppb

1. 交叉反應率

氯黴素 ·············································· 100%

甲碸黴素 ········································· < 0.1%

氟甲碸黴素 ······································ < 0.1%

1. 樣本回收率

組織、蛋類、奶粉····························· 85%±20% 蜂蜜、牛奶、飼料····························· 93%±25%

尿樣··········································  100%±25%

三、試劑盒組成

四、所用儀(yi) 器、試劑

具備的儀(yi) 器：酶標儀(yi) 、均質器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量 0.01g）、氮吹儀(yi) 、恒溫箱

微量移液器：單道 20～200µl、單道 100～1000µl、

多道 30～300 µl

試 劑：乙酸乙酯、正己烷

五、樣本前處理步驟

1. 樣本處理前須知

（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。

（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否幹淨，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免汙染幹擾實驗結果。

1. 樣本前處理需配製：配液 1 樣本複溶液：

• 2X 濃縮複溶液用去離子水按 1：1 稀釋。

1. 樣本處理：

（a）肌肉組織樣本處理方法

1、稱取均質後的新鮮樣本 3±0.05g 於(yu)  50ml 離心管中，加入 3ml 去離子水後再加入 6ml 乙酸乙酯，振蕩 1min，室溫 4000r/min 以上離心 10min；

2、取出 4ml 上層液體(ti) 在 50-60℃氮氣流中吹幹；

3、加入 1 ml 正己烷溶解幹燥的殘留物，再加 1ml 樣本複溶液混合 30s，室溫 4000r/min 以上離心10min；去除上層有機相；

4、取 50 µl 下層相用於(yu) 分析。

樣本稀釋倍數:  0.5 倍

此方法無法檢測肝髒類樣本，處理時易出現乳化現象，影響檢測結果(乳化時建議處理方法：去除上層有機相再加入 2ml 正己烷混合 30s，室溫 4000r/min

以上離心 10min；去除上層有機相)。（b）蜂蜜處理方法

1、稱取 2±0.05 g 蜂蜜，放入離心管中，用 2ml 去離子水溶解；加入 6ml 乙酸乙酯振蕩 1min，室溫 4000r/min 以上離心 10min；

2、移取 3ml 上層清澈液到另一離心管中，50-60℃氮氣流下幹燥；用 0.5ml 樣本複溶液溶解幹燥的殘留物，混合 30s；

3、取 50 µl 用於(yu) 分析。

樣本稀釋倍數： 0.5 倍

（c）牛奶、奶粉、蛋類樣本處理方法

1、稱取均質後的新鮮樣本 2±0.05g（或 2ml）於(yu)  50ml 離心管中，加入 6ml 乙酸乙酯，振蕩 1min，

室溫 4000r/min 以上離心 10min；2、取出 3ml 上層液體(ti) 在 50-60℃氮氣流中吹幹；

3、加入 1 ml 正己烷溶解幹燥的殘留物，再加 1ml 樣本複溶液混合 30s，室溫 4000r/min 以上離心10min；去除上層有機相；

4、取 50 µl 下層相用於(yu) 分析。

樣本稀釋倍數:  1 倍

處理時如無法取到 3ml 上層液體(ti) ，可以重複離心後再取液，或加入 10ml 乙酸乙酯後取 5ml 吹幹，稀釋倍數不變。

（d）尿樣、飼料樣本處理方法

1、稱取均質後的新鮮樣本 1±0.05g（或 1ml）於(yu)  50ml 離心管中，加入 6ml 乙酸乙酯，振蕩 1min，

室溫 4000r/min 以上離心 10min；2、取出 3ml 上層液體(ti) 在 50-60℃氮氣流中吹幹；

3、加入 1 ml 正己烷溶解幹燥的殘留物，再加 1ml 樣本複溶液混合 30s，室溫 4000r/min 以上離心10min；去除上層有機相；

4、取 50 µl 下層相用於(yu) 分析。

樣本稀釋倍數:  2 倍

六、酶標免疫分析程序:

1. 測定前應須知：

1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫

（20～25℃）。

2、 使用之後立即將所有試劑放回 2～8℃。

3、 在 ELISA 分析中的再現性，很大程度上取決(jue) 於(yu) 洗板的*性，正確的洗板操作是 ELISA 測定程序中的要點。

4、 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。

1. 操作步驟：

1、從(cong)  2～8℃冷藏環境中取出所需試劑，室溫（20～

25℃）平衡 30min 以上，注意每種液體(ti) 試劑使用前均須搖勻。

2、取出框架及需要數量的微孔，將不用的微孔放

入自封袋，保存於(yu) 2-8℃。

3、配液：將 40ml 濃縮洗滌液（20 倍濃縮）用去離子水按照 1：19 稀釋（1 份濃縮洗滌液+19 份去離子水），或按所需用量配製洗滌液。

4、編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個(ge) 樣本和標準品做 2 孔平行，並記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

5、加標準品/樣本 50µl/孔到各自的微孔中，然後加入酶標記物 50µl/孔，後加入抗體(ti) 工作液 50µl/ 孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻。25℃環境

中反應 30min。

6、將孔內(nei) 液體(ti) 甩幹，用已稀釋的洗滌液 250µl/孔洗板 4～5 次，每次間隔 15～30 秒，用吸水紙拍幹（拍幹後未清除的氣泡可用幹淨的槍頭刺破）。

7、顯色：加入底物 A 液 50µl/孔，再加入底物 B 液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環境中避光顯色 15min。

8、測定：加入終止液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀(yi) 於(yu) 450nm 處（建議用雙波長 450/630n m 檢測，5min 內(nei) 讀數），測定每孔 OD 值。

七、結果判定

結果判定有兩(liang) 種方法，粗略判定可用第 1 種方法，定量判定用第 2 種方法。注意樣本吸光度值與(yu) 其所含氯黴素量成負相關(guan) 。

1、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與(yu) 標準值比較即可得出其濃度範圍(ng/ml)。假設樣本 1 的吸光度值為(wei) 0.3，樣本 2 的吸光度值為(wei) 1.0，標準液吸光度值分別是：

 0ppb 為(wei)  2.143；0.02ppb 為(wei)  1.816；0.06ppb 為(wei)  1.415； 0.18ppb 為(wei)  0.74；0.54ppb 為(wei)  0.313；1.62ppb 為(wei)  0.155。則樣本 1 的濃度範圍是 0.54ppb～1.62ppb；樣本 2

 的濃度範圍是 0.06ppb～0.18ppb，乘以其對應

稀釋倍數 即為(wei) 樣本中氯黴素實際濃度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等於(yu) 標準品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以*個(ge) 標準（0 標準）的吸光度值，再乘以 100%，即

B

百分吸光率（%）＝ ×100%

B0

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0ng/ml 標準溶液的平均吸光度值（2）標準曲線的繪製與(yu) 計算

以標準品百分吸光率為(wei) 縱坐標，以氯黴素標準品濃度（ng/ml）的半對數為(wei) 橫坐標，繪製標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從(cong) 標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為(wei) 樣本中氯黴素實際濃度。

若利用試劑盒專(zhuan) 業(ye) 分析軟件進行計算，更便於(yu) 大量樣本的準確、快速分析。 

八、 注意事項

1、室溫低於(yu)  25℃或試劑及標本未回到室溫（20～

25℃）會(hui) 導致所有標準的 OD 值偏低。

2、在洗板過程中如果出現板孔幹燥的情況，則會(hui) 伴隨著標準曲線不成線性，重複性不好的現象。所以洗板拍幹後應立即進行下一步操作。

3、混合要均勻，否則會(hui) 出現重複性不好的現象。

4、反應終止液為(wei)  2M 硫酸，避免接觸皮膚。

5、不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會(hui) 引起靈敏度、OD 值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、不用的微孔板放進自封袋重新密封；標準物質和無色的發色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。標準品 1 的吸光度值小於(yu) 0.5 時，表示試劑可能變質。

8、該試劑盒理想反應溫度為(wei)  25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。

九、儲(chu) 藏條件和保質期

1、儲(chu) 藏條件：試劑盒於(yu)  2-8℃保存，不要冷凍。

2、保 質 期：該產(chan) 品有效期為(wei)  1 年，生產(chan) 日期見包裝盒。

提示：酶標板真空包裝袋若有漏氣，酶標板仍然正常有效，不影響實驗結果，請放心使用。

林可黴素檢測試劑盒
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