免疫熒光染色實驗服務

一、製片

選無自發性熒光的石英玻片或普通優(you) 質玻片，洗淨後浸泡於(yu) 無水乙醇和乙氧基乙烷等量混合液中。用時取出用綢布擦淨。將待檢樣品如組織塊剪成適當大小印壓於(yu) 玻片上。也可采用冰凍切片或石蠟切片樣品。

二、固定

除研究細胞表麵抗原或不穩定抗原可不固定外，--般均應固定。

固定的作用有三:

1.防止標本從(cong) 玻片上脫落。

2.除去防礙抗原抗體(ti) 結合的類脂，使抗原抗體(ti) 結合物易於(yu) 獲得良好的染色結果。

3.固定的標本易於(yu) 保存，如組織切片固定後在-20%C下可保存一年而不改變其染色特性。

標本的固定原則是:

1.不能損傷(shang) 細胞內(nei) 的抗原。

2.不能凝集蛋白質。

3.不能損傷(shang) 細胞形態。

4.固定後應保持細胞膜的通透性，以允許抗體(ti) 進入與(yu) 抗原結合。

三、水洗

固定後以冷的0.01 Mol/L pH7 4PBS液浸泡衝(chong) 洗，後以蒸餾水衝(chong) 洗，防止自發性熒光。

四、染色

染色分直接染色法與(yu) 間接染色法。

1.材料與(yu) 試劑

(1)熒光抗體(ti) ，稀釋至應用濃度。

(2) 0.01 Mol/L pH7 .4PBS液

(3) 9份優(you) 質甘油加1份pH7 .4PBS液即為(wei) 甘油緩衝(chong) 液。甘油有減少非特異性熒光的作用。

(4)帶蓋方盤。

2. 直接染色法

(1)將固定好的玻片置於(yu) 濕盤中，滴加熒光抗體(ti) 染色液，以覆蓋為(wei) 度，加蓋，37°C感做30min~45min.

(2) PBS衝(chong) 洗3次，每次衝(chong) 洗3 min,即3x3衝(chong) 洗。

(3)蒸餾水衝(chong) 洗。

(4)滴甘油緩衝(chong) 液一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。

3.間接染色法

(1) 檢查抗原:

①取固定標本，加已知的免疫血清，37°C孵育30 min。

②以PBS液3x3衝(chong) 洗。

③再加熒光標記的抗抗體(ti) ，37°C孵育30 min。

④PBS 3x3衝(chong) 洗。

⑤H2O衝(chong) 洗，涼幹。

⑥加甘油緩衝(chong) 液，封片、鏡檢。

(2)檢查抗體(ti) :

①兔疫後動物的淋巴組織塗片，自然幹燥，甲醇固定。

②滴加相應抗原液(按1: 100~1: 500稀釋)， 37°C孵育30 min.

③PBS液3x3衝(chong) 洗。

④加熒光抗體(ti) ，37°C孵育30 min.

⑤PBS液3x3衝(chong) 洗。

⑥水洗，幹。

⑦加甘油緩衝(chong) 液，封片、鏡檢。

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