多克隆抗體(ti) 製備服務

多抗一般製備流程:*抗原的準備- +兔子的免疫-→ 效價(jia) 檢測和終放- +抗體(ti) 親(qin) 和純化- +抗體(ti) 的濃縮和保存。

具體(ti) 實驗步驟如下:

1.兔子的準備

挑選健康的6周大小的新西蘭(lan) 大白兔兩(liang) 隻(約2Kg) ，使其適應新的生活環境，至少穩定幾天再進行*取血、預采血(作陰性參照用)

1.1將兔子小心的放入固定的架中，使兔子平靜;

1.2小心剃去兔耳上的毛以使血管清晰可見(也可不剃);

1.3如果有必要，可用小棉球沾酒精塗抹血管部位使血管膨脹;

1.4用注射器從(cong) 耳靜脈抽取約10ml血液(約5ml血清);

1.5小心抽出針頭，適當按壓傷(shang) 口以免流血，然後用酒精棉球消毒傷(shang) 口;

1.6將收集的血液置於(yu) 37 C滅活30min,後置於(yu) 4" C過夜使其凝結釋放血清;

1.7將凝結好的血液在10000r / min離心10min; h.收集 上清，即為(wei) 血清。

兔子的免疫

2.1注射兩(liang) 隻兔子的抗原為(wei) 1ml,抗原緩衝(chong) 溶液必須不含對兔子有害的化學試劑每隻兔子初次免疫400ug抗原比較適合，也可適當減少以獲得更好的結果，後續免疫每次為(wei) 100ug即可。

2.2將1m的佛氏*佐劑與(yu) 準備好的1m抗原充分混勻，呈乳白色; .

2.3小心從(cong) 籠中取出兔子,織兔子免疫4個(ge) 部位(背部和大腿根部均可)，每個(ge) 部位250ul,針頭呈45度角插入皮下1-2cm,注射完後停留數秒以防止抗原外流。

2.4兔疫周期為(wei) 20天，免疫完後7-10天取血(包括中途測試取血和終放血)，總共免疫4-5次。

3.效價(jia) 檢測

3.1 2個(ge) 參照陰性參照為(wei) 預取血血清，均以1抗起始濃度稀釋(封閉稀釋液);陽性參照為(wei) 以前

陽性血清

3.2於(yu) 96孔板中每孔滴加100ul, 1ug/m抗原，於(yu) 49C過夜， 也可以37°C孵育2小時。

3.3倒掉抗原溶液，每孔加入200u的封閉液， 49C過夜或者379C孵育2小時。

3.4倒去封閉液，在吸水紙上拍打盡量吸幹殘留液體(ti) ，用洗滌液洗板三次每次盡量拍幹殘留液體(ti) ，若要放置一段時間, 37°C烘幹並用封口袋封好於(yu) 20°C存放。

3.5取包被好的96孔板，第---孔加入陰性 參照液100ul,第二孔加入陽性參照液100ul,第三孔加入1:500的待測抗血清，後續各孔在此基礎上倍比稀釋,於(yu) 37°C孵育1 小時。

3.6倒掉液體(ti) ，用洗滌液洗板三次,拍幹。每孔加入100u的HRP標記的小鼠抗兔lgG (1: 2000稀釋)，於(yu) 37°C孵育45分鍾。

3.7倒掉液體(ti) ，用洗滌液洗板三次，拍幹。每孔加入100u的TMB底物(Sigma 單組份TMB ) 37°C孵育5-20分 鍾(根據顏色深淺來決(jue) 定顯色的時間)。

3.8每孔加入50u的終止液(2N H2SO4)， 在酶標儀(yi) 上讀取波長450nm處的吸光值。

抗體(ti) 效價(jia) 檢測達到100萬(wan) 以上後可以對兔子進行終放血。

抗體(ti) 的純化

4.抗體(ti) 的親(qin) 和--親(qin) 和柱的製備

4.1 稱取1mg CNBr- Sepherose 4B的瓊脂糖凝膠加入2mmol/ L的鹽酸中，4" C過夜使其充分溶漲，可獲得3m溶漲膠。

4.2將凝膠轉移入純化柱中，用約20ml 2mmol / L的鹽酸洗介質3次。

4.3用偶聯緩衝(chong) 液洗介質- -次，因為(wei) 活化基團在偶聯緩衝(chong) 液PH值下易水解，所以此步驟在幾分鍾內(nei) 完成。

4.4將溶解在5ml偶聯緩衝(chong) 液中的5-10mg的抗原加入凝膠中

4.5室溫下輕輕混合搖動2-4小時，或4" C過夜,如需測定結合效率此步驟結束後取少量溶液待測。用20ml的偶聯緩衝(chong) 液洗介質一-次。

4.6加入15m1 1% BSA溶液室溫下孵育2小時或4" C過夜。

4.7用磷酸鹽緩衝(chong) 液洗滌介質3次以上,每次15m以上h.

4.8抗原固相化完成，可用於(yu) 純化。

4.9若不立即使用或者使用後，用20%的乙醇封存。

5.抗血清的純化和保存

5.1抗血清用PBS等體(ti) 積稀釋，5000-10000 / min離心15分鍾，取上清.

5.2用10倍體(ti) 積的PBS清洗抗原親(qin) 和柱以平衡柱子。

5.3將稀釋好的抗血清10m加入平衡好的柱子中。

5.4室溫下輕輕混合搖動2-4小時，或4" C過夜

5.5用10倍體(ti) 積的PBS清洗抗原柱，以洗去結合在柱子上的雜蛋白

5.6用2倍體(ti) 積的抗體(ti) 洗脫液洗滌柱子，以得到特異性抗體(ti)

5.7用10倍體(ti) 積PBS平衡柱子

5.8用20%的酒精封存柱子，4'C保存。

在得到洗脫的抗體(ti) 後，經蔗糖或聚乙二醇濃縮後於(yu) PBS中透析除鹽，使用紫外可見分光光度計在波長280nm處測定抗體(ti) OD值，所得OD值除以1.35即為(wei) 所測抗體(ti) 的濃度，添加40-50%甘油置於(yu) 20^C可長期保存。

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